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**產(chǎn)品毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)規(guī)范
日期：2025-02-22 17:46
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摘要：
2.3.1急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)
2.3.1.1 目的
（1)檢測(cè)**劑對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的急性毒性作用和強(qiáng)度。
（2)為亞急（慢）性毒性等試驗(yàn)提供劑量選擇的依據(jù)。
2.3.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
小鼠或大鼠任選一種，雌雄各半。小鼠體重18g～22g，大鼠體重180g～220g，根據(jù)不同的計(jì)算LD50方法，選用適當(dāng)?shù)膭?dòng)物數(shù)量。
2.3.1.3 試驗(yàn)分組
如應(yīng)用概率單位-對(duì)數(shù)圖解法計(jì)算LD50，隨機(jī)分為5個(gè)～6個(gè)劑量組。通常*高劑量組的動(dòng)物死亡率應(yīng)≥90%，*低劑量組動(dòng)物死亡率應(yīng)≤10%。可先以較大的組距較少量動(dòng)物進(jìn)行預(yù)試，找出其粗略致死劑量范圍，然后再設(shè)計(jì)正式試驗(yàn)的劑量分組。
2.3.1.4 操作程序
（1）動(dòng)物的準(zhǔn)備：試驗(yàn)前，一般禁食過夜，不限制飲水。
（2）受試物的配制：常以水或食用植物油為溶劑配制成溶液，或采用0.5%羧甲基纖維素配制成混懸液。灌胃給予受試物的*大容量，小鼠不超過0.2ml/10g體重，大鼠不超過1.0ml/100g體重。
（3）染毒方法：用灌胃方式將受試物一次給予動(dòng)物。若受試物毒性很低，一次灌胃容量太大，可在24h內(nèi)分成2次～3次給予，其總劑量作為一日劑量計(jì)算。
（4）染毒后觀察動(dòng)物的中毒表現(xiàn)和死亡數(shù)及死亡時(shí)間，并對(duì)死亡動(dòng)物和觀察期滿處死動(dòng)物進(jìn)行尸體解剖，肉眼觀察，發(fā)現(xiàn)有異常的組織或臟器，尚需進(jìn)一步作組織病理學(xué)檢查。觀察時(shí)間14d。
2.3.1.5LD50的計(jì)算方法
根據(jù)給受試物后14d內(nèi)的各劑量組動(dòng)物死亡率計(jì)算LD50半數(shù)致死劑量)。 (
2.3.1.5.1概率單位-對(duì)數(shù)圖解法：
（1）根據(jù)各劑量組動(dòng)物死亡率，從表2-9 中查各組的概率單位。因死亡率為 0% 和100%的概率單位，與所試動(dòng)物數(shù)有關(guān)，故需另在表2-10中查找。
例如：對(duì)死亡率為45%的概率單位，可查表2-9。先在表的左側(cè)縱標(biāo)目上找到40，而后在表的上行橫標(biāo)目處找到5，兩者交叉點(diǎn)處的4.87，即為45% 的概率單位。
又如:某組用 10只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如果全部存活(死亡率為0%)，查表2-10，其概率單位為 3.04。
表2-9 百分率-概率單位換算表
% 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0 .. 2.67 2.95 3.12 3.25 3.36 3.45 3.52 3.59 3.66
10 3.72 3.77 3.82 3.87 3.92 3.96 4.01 4.05 4.08 4.12
20 4.16 4.19 4.23 4.26 4.29 4.33 4.36 4.39 4.42 4.45
30 4.48 4.50 4.53 4.56 4.59 4.61 4.64 4.67 4.69 4.72
40 4.75 4.77 4.80 4.82 4.85 4.87 4.90 4.92 4.95 4.97
50 5.00 5.03 5.05 5.08 5.10 5.13 5.15 5.18 5.20 5.23
60 5.25 2.28 5.31 5.33 5.36 5.39 5.41 5.44 5.47 5.50
70 5.52 5.55 5.58 5.61 5.64 5.67 5.71 5.74 5.77 5.81
80 5.84 5.88 5.92 5.95 5.99 6.04 6.08 6.13 6.18 6.23
90 6.28 6.34 6.41 6.48 6.55 6.64 6.75 6.88 7.05 7.33
注: 橫標(biāo)目數(shù)字為死亡率的個(gè)位數(shù)，縱標(biāo)目數(shù)字為死亡率的十位數(shù)。
表2-10 相應(yīng)于反應(yīng)率為 0％及100％的概率單位
該組動(dòng)物數(shù) 反應(yīng)率 該組動(dòng)物數(shù) 反應(yīng)率
0% 100% 0% 100%
... ... ... 11 3.00 7.00
2 3.85 6.15 12 2.97 7.03
3 3.62 6.38 13 2.93 7.07
4 3.47 6.53 14 2.90 7.10
5 3.36 6.64 15 2.87 7.13
6 3.27 6.73 16 2.85 7.15
7 3.20 6.80 17 2.82 7.18
8 3.13 6.87 18 2.80 7.20
9 3.09 6.91 19 2.78 7.22
10 3.04 6.96 20 2.76 7.24
（2)用方格紙繪散點(diǎn)圖，橫軸表示劑量的對(duì)數(shù)值(X)，縱軸為概率單位值(Y)，將各組數(shù)值點(diǎn)在圖上。
（3)按各點(diǎn)的分布趨勢(shì)，用直尺繪出一條*適合于各點(diǎn)的直線，使線上方的點(diǎn)到線的總距離與線下方的點(diǎn)到線的總距離相近，此線應(yīng)盡量靠近概率單位為 5的點(diǎn)及附近的點(diǎn)。
（4） 查出求概率單位 5 處的劑量對(duì)數(shù)，其反對(duì)數(shù)即為L(zhǎng)D50。
按下列公式計(jì)算 LD50的 95%可信限。
S =(X2 －X1－Y1))/(Y2
Sm=S/(N'/2)-1/2
LD50對(duì)數(shù)值的95%可信限 = logLD50 ±1.96Sm
(上式結(jié)果，經(jīng)反對(duì)數(shù)變換后，可得LD50的95%可信限)
[Sm為 LD50的標(biāo)準(zhǔn)誤；S為標(biāo)準(zhǔn)差；X1、X2分別為機(jī)率單位等于4(Y1和6(Y2時(shí)相應(yīng)的劑量對(duì)數(shù)值；N'為Y1及Y2相應(yīng)的死亡率間所用的動(dòng)物數(shù)]。(=6)(=4)))
2.3.1.5.2一次*大限度試驗(yàn)：
如20只動(dòng)物(雌雄各半)一次灌胃劑量5000mg/kg體重，在14d內(nèi)又無死亡，可判定LD50大于5000mg/kg體重。
2.3.1.5.3其他方法：如霍恩(Horn)法、寇氏(Karber)法等。
2.3.1.6 評(píng)價(jià)規(guī)定
**劑的毒性評(píng)價(jià)：
LD50大于5000mg/kg體重者屬實(shí)際無毒；
LD50為501mg/kg～5000mg/kg體重者屬低毒；
LD50為51mg/kg～500mg/kg體重者屬中等毒；
LD50為1mg/kg～50mg/kg體重者屬高毒；
LD50小于1mg/kg體重者屬劇毒。
注：為評(píng)價(jià)**劑在實(shí)際應(yīng)用時(shí)對(duì)人體的**性，當(dāng)產(chǎn)品原形LD50≤5000mg/kg體重時(shí)，需增做**劑*高應(yīng)用液濃度5倍溶液的急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)，并計(jì)算其LD50。
2.3.2急性吸入毒性試驗(yàn)
2.3.2.1 目的
檢測(cè)**劑對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的急性吸入毒性作用和強(qiáng)度。
2.3.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
小鼠或大鼠任選一種，雌雄各半。小鼠體重為18g～22g，大鼠體重為180g～200g。
2.3.2.3 操作程序
染毒可采用靜式染毒法或動(dòng)式染毒法。
2.3.2.3.1 靜式染毒法
靜式染毒是將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放在一定體積的密閉容器（染毒柜）內(nèi)，加入一定量的**劑，并使其揮發(fā)，造成實(shí)驗(yàn)需要**劑濃度的空氣，一次吸入性染毒2h。
（1）染毒柜的容積以每只染毒小鼠每小時(shí)不少于3L空氣計(jì)，每只大鼠不少于30L計(jì)。
（2）染毒濃度的計(jì)算：染毒濃度一般應(yīng)采用實(shí)際測(cè)定濃度。在染毒期間一般可測(cè)4次~5次，求其平均濃度。在無適當(dāng)測(cè)試方法時(shí)?？捎孟率接?jì)算染毒濃度
a×d
C= ×106
V
式中: C— 染毒濃度（mg/m3）
a— 加入**劑量(ml)
d— **劑比重
V— 染毒柜容積（L）
2.3.2.3.2 動(dòng)式染毒法
動(dòng)式染毒是采用機(jī)械通風(fēng)裝置，連續(xù)不斷地將含有一定濃度**劑的空氣均勻不斷地送入染毒柜，并排出等量的染毒氣體，維持相對(duì)穩(wěn)定的染毒濃度。一次吸入性染毒2h。
（1）**劑氣化（霧化）和輸入的常用方法
1） 氣體**劑，經(jīng)流量計(jì)與空氣混合成一定濃度后，直接輸入染毒柜。
2） 易揮發(fā)液體**劑，通過空氣鼓泡或適當(dāng)加熱促使揮發(fā)后輸入染毒柜。
3） 若**劑現(xiàn)場(chǎng)使用采取噴霧法時(shí)，可采用噴霧器或超聲霧化器使其霧化后輸入染毒柜。
（2）染毒濃度計(jì)算 染毒濃度一般應(yīng)采用動(dòng)物呼吸帶實(shí)際測(cè)定濃度，每半小時(shí)一次，取其平均值。若無適當(dāng)?shù)臏y(cè)試方法，也可采用以下公式計(jì)算染毒濃度：
a×d
C= ×106
V1+ V2
式中： C— 染毒濃度（mg/m3）
a— 氣化或霧化**劑量(ml)
d— **劑比重
V1— 輸入染毒柜風(fēng)量(L)
V2— 染毒柜容積（L）
2.3.2.3.3觀察和記錄染毒過程和觀察期內(nèi)的動(dòng)物癥狀和死亡情況。關(guān)于染毒濃度的設(shè)計(jì)、動(dòng)物分組、觀察期限、觀察指標(biāo)和LC50（半數(shù)致死濃度）的計(jì)算等可參照急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)(2.3.1)。
在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，如20只動(dòng)物（雌雄各半）一次2h吸入染毒濃度10000mg/m3，在14d內(nèi)無死亡，可判定LC50大于10000mg/m3。
2.3.2.4評(píng)價(jià)規(guī)定
**劑的毒性評(píng)價(jià)：
LC50 2h大于10000mg/m3 者屬實(shí)際無毒；
LC50 2h為1001mg/m3～10000mg/m3 者屬低毒；
LC50 2h為101mg/m3～1000mg/m3 者屬中等毒；
LC50 2h為10mg/m3～100mg/m3 者屬高毒；
LC50小于10mg/m3者屬劇毒。 2h
2.3.3 皮膚刺激試驗(yàn)
2.3.3.1 目的
檢測(cè)**劑對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚的刺激/腐蝕作用和強(qiáng)度。
2.3.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
每次試驗(yàn)至少需 3 只皮膚完好的健康家兔或豚鼠。
2.3.3.3 操作程序
2.3.3.3.1一次完整皮膚刺激試驗(yàn)
(1)在試驗(yàn)前24h，用脫毛劑將家兔或豚鼠背部脊柱兩側(cè)的毛去掉，不得損傷皮膚。去毛范圍，左、右各約3cm×3cm。
(2)次日將受試物(濃度一般為皮膚**應(yīng)用液的5倍或原液0.5ml（g）直接滴于面積為2.5cm×2.5cm的一側(cè)去毛完整皮膚上，或滴于同樣大小的2層~4層紗布上并敷貼在一側(cè)去毛皮膚表面，然后用一層無刺激塑料膜或油紙覆蓋，再用無刺激膠布固定。另一側(cè)去毛皮膚作為空白對(duì)照(或溶劑對(duì)照)。敷貼時(shí)間為4h。試驗(yàn)結(jié)束后，用溫水或無刺激性溶劑除去殘留受試物。
(3)分別于去除受試物后1h、24h和48h觀察皮膚局部反應(yīng)，并按表2-11進(jìn)行刺激反應(yīng)評(píng)分。
2.3.3.3.2 一次破損皮膚刺激試驗(yàn)
（1）涂受試物前，在2.5cm×2.5cm的去毛皮膚上，用75％酒精清潔、**暴露皮
膚，待酒精揮發(fā)后，用**刀片或注射針頭在皮區(qū)內(nèi)劃一個(gè)“井”形的破損傷口，并在該破損皮區(qū)內(nèi)染毒。注意皮膚破損僅達(dá)表皮，不要傷及真皮。
（2）手術(shù)前的皮膚準(zhǔn)備，手術(shù)后受試物涂抹和局部皮膚反應(yīng)的觀察，評(píng)分方法同
2.3.3.3.1。注意鑒別感染和原發(fā)性刺激反應(yīng)的區(qū)別，若有感染可疑，應(yīng)進(jìn)行重復(fù)測(cè)試。
2.3.3.3.3多次完整皮膚刺激試驗(yàn)
（1）試驗(yàn)前動(dòng)物皮膚準(zhǔn)備同2.3.3.3.1 （1）。
（2）次日將受試物[濃度同2.3.3.3.1(2)]0.5ml（g）涂在一側(cè)皮膚上，另一側(cè)涂溶劑作為對(duì)照，在涂抹后4h，用水或無刺激的適宜溶劑清洗，除去殘留物。每天涂抹一次，連續(xù)涂抹14d。在每次涂抹后24h觀察結(jié)果，按表2-11評(píng)分。為了便于受試物的涂抹和結(jié)果觀察，必要時(shí)應(yīng)剪毛。對(duì)照區(qū)的處理方法同試驗(yàn)區(qū)。
2.3.3.4 評(píng)價(jià)規(guī)定
2.3.3.4.1一次皮膚刺激試驗(yàn)
在各個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)，按照表2-11對(duì)動(dòng)物的皮膚紅斑與水腫形成情況進(jìn)行評(píng)分，并分別按時(shí)間點(diǎn)將3只動(dòng)物的評(píng)分相加，除以動(dòng)物數(shù)，獲得不同時(shí)間點(diǎn)的皮膚刺激反應(yīng)積分均值(刺激指數(shù))。取其中*高皮膚刺激指數(shù)，按表2-12評(píng)定該受試物對(duì)動(dòng)物皮膚刺激強(qiáng)度的級(jí)別。
2.3.3.4.2多次皮膚刺激試驗(yàn)
按下列公式計(jì)算每天每只動(dòng)物平均積分（刺激指數(shù)），并以表2-12判定皮膚刺激強(qiáng)度。
∑（每只動(dòng)物14d的紅斑和水腫總積分）
每天每只動(dòng)物平均積分=
受試動(dòng)物數(shù)×14
表2-11 皮膚刺激反應(yīng)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
皮膚刺激反應(yīng) 皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分
紅斑形成：
無 0
勉強(qiáng)可見 1
明顯 2
嚴(yán)重 3
紫紅色紅斑，并有焦痂 4
水腫形成:
無 0
勉強(qiáng)可見 1
皮膚隆起，輪廓清楚 2
水腫隆起約1mm 3
水腫隆起超過1mm 4
表2-12 皮膚刺激強(qiáng)度分級(jí)
皮膚刺激指數(shù) 刺激強(qiáng)度級(jí)別
0～＜0.5 無刺激性
0.5～＜2.0 輕刺激性
2.0～＜6.0 中等刺激性
6.0～8.0 強(qiáng)刺激性
2.3.4急性眼刺激試驗(yàn)
2.3.4.1 目的
檢測(cè)**劑對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物眼睛的急性刺激和腐蝕作用。
2.3.4.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
使用3只家兔。試驗(yàn)前檢查家兔雙眼，有異常者不能用于試驗(yàn)。
2.3.4.3 操作程序
（1）受試物一般為黏膜**或空氣**應(yīng)用液的5倍濃度的溶液或原液。吸取受試物0.1ml，滴入家兔一側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)。另一側(cè)眼以生理鹽水作為正常對(duì)照。
（2）滴受試物后，將眼被動(dòng)閉合4s，30s后用生理鹽水沖洗。于滴眼后1h、24h、48h、72h、7d、14d和21d，肉眼觀察家兔眼結(jié)膜、虹膜和角膜的損傷與恢復(fù)情況。如果72h內(nèi)未出現(xiàn)刺激反應(yīng)，或第7d或第14d，眼睛刺激反應(yīng)完全恢復(fù)，即可提前終止試驗(yàn)。必要時(shí)，用2% 熒光素鈉溶液或裂隙燈、放大鏡檢查角膜及虹膜變化。
2.3.4.4 評(píng)價(jià)規(guī)定
按表2-13對(duì)家兔眼角膜、虹膜和結(jié)膜的急性刺激反應(yīng)進(jìn)行評(píng)分，并分別計(jì)算每只動(dòng)物在三個(gè)不同觀察時(shí)間（24h、48h和72h）角膜損害、虹膜損害、結(jié)膜充血和結(jié)膜水腫四方面的“平均評(píng)分”（即每只動(dòng)物的24h、48h和72h評(píng)分之和除以觀察數(shù)3）。分別以動(dòng)物眼角膜、虹膜和結(jié)膜充血、水腫的平均評(píng)分和恢復(fù)時(shí)間進(jìn)行，按表2-14、表2-15眼刺激反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定受試物對(duì)眼睛的刺激強(qiáng)度。
表2-13 家兔急性眼刺激反應(yīng)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
眼損害表現(xiàn) 評(píng) 分
角膜損害：
無潰瘍形成或混濁 0
散在或彌漫性混濁，虹膜清晰可見 1
半透明區(qū)易分辨，虹膜模糊不清 2
出現(xiàn)灰白色半透明區(qū)，虹膜細(xì)節(jié)不清，瞳孔大小勉強(qiáng)可見 3
角膜不透明，混濁，虹膜無法辨認(rèn) 4
虹膜損害：
正常 0
皺褶明顯加深，充血，腫脹，角膜周圍有中度充血，
瞳孔對(duì)光仍有反應(yīng) 1
出血、肉眼可見破壞，或瞳孔對(duì)光無反應(yīng) 2
結(jié)膜（瞼結(jié)膜、球結(jié)膜）充血
血管正常 0
血管充血呈鮮紅色 1
血管充血呈深紅色，血管不易分辨 2
彌漫性充血呈紫紅色 3
結(jié)膜（瞼結(jié)膜、球結(jié)膜）水腫
無水腫 0
輕微水腫(包括瞬膜) 1
明顯水腫，伴有部分眼瞼外翻 2
水腫至眼瞼近半閉合 3
水腫至眼瞼大半閉合 4
表2-14 眼刺激性反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)
可 逆 性 損 傷 | 無刺激性 | 3只動(dòng)物的平均評(píng)分：角膜損害＜1、虹膜損害＜1、結(jié)膜充血＜2和結(jié)膜水腫＜2或3只動(dòng)物中至少有2只動(dòng)物的平均評(píng)分符合上述標(biāo)準(zhǔn)。另外1只動(dòng)物的刺激反應(yīng)在21d內(nèi)完全恢復(fù)。 |
輕刺激性 | 3只動(dòng)物中有2只動(dòng)物的平均評(píng)分：角膜損害≥1；虹膜損害≥1；結(jié)膜充血≥2；結(jié)膜水腫≥2，且7d內(nèi)全部動(dòng)物的刺激反應(yīng)完全恢復(fù)。 | |
刺激性** | 3只動(dòng)物中有2只動(dòng)物的平均評(píng)分：角膜損害≥1；虹膜損害≥1；結(jié)膜充血≥2；結(jié)膜水腫≥2，且21d內(nèi)全部動(dòng)物的刺激反應(yīng)完全恢復(fù)。 | |
不可逆性損傷 | 腐蝕性*** | 至少有1只動(dòng)物的角膜、虹膜或結(jié)膜的刺激反應(yīng)在21d的觀察期內(nèi)未完全恢復(fù)或/和在3只動(dòng)物中有2只動(dòng)物的平均評(píng)分：角膜損害≥3；虹膜損害≥1.5。 |
注：完全恢復(fù)是指動(dòng)物的眼刺激反應(yīng)評(píng)分：角膜損害=0，虹膜損害=0，結(jié)膜充血=0或1，
結(jié)膜水腫=0或1。
** 刺激性：接觸受試物后所產(chǎn)生的可逆性炎性反應(yīng)。
*** 腐蝕性：接觸受試物后所產(chǎn)生的不可逆性組織損傷。
表2-15 眼刺激性反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)
平均評(píng)分 | 動(dòng)物數(shù)（只） | 恢復(fù)時(shí)間（d）* | 損傷類型 |
角膜損害＜1和 虹膜損害＜1和 結(jié)膜充血＜2和 結(jié)膜水腫＜2 | ≥2 | ≤21 | 無刺激性 |
角膜損害≥1或 虹膜損害≥1或 結(jié)膜充血≥2或 結(jié)膜水腫≥2 | ≥2 | ≤7 | 輕刺激性 |
≤21 | 刺激性 | ||
角膜損害≥3或 虹膜損害≥1.5 | ≥2 | 腐蝕性** | |
角膜損害≥1或 虹膜損害≥1或 結(jié)膜充血≥1或 結(jié)膜水腫≥1 | ≥1 | ＞21 |
*:恢復(fù)時(shí)間:為動(dòng)物刺激反應(yīng)評(píng)分恢復(fù)至角膜損害=0，虹膜損害=0，結(jié)膜充血=0或1，結(jié)膜水腫=0或1
的時(shí)間。
**：腐蝕性：至少有1只動(dòng)物于21d尚存在角膜粘連或血管翳，也可判為腐蝕性。
2.3.5**黏膜刺激試驗(yàn)
2.3.5.1目的
檢測(cè)**劑對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物**黏膜的刺激作用和強(qiáng)度。
2.3.5.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
選用健康、初成年的雌性白色家兔，同一品系，體重2.0kg~2.5kg。試驗(yàn)前應(yīng)檢查動(dòng)物**口有無分泌物、充血、水腫和其它損傷情況。如有炎癥或（和）損傷，應(yīng)棄用。*好選擇動(dòng)物的非動(dòng)情期做試驗(yàn)。
2.3.5.3試驗(yàn)分組
分為染毒組和對(duì)照組，每組3只。
表2-16 **黏膜刺激反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
**組織反應(yīng) | 反應(yīng)評(píng)分 |
A．上皮組織 | |
正常，完好無損 | 0 |
細(xì)胞變性或變扁平 | 1 |
組織變形 | 2 |
局部糜爛 | 3 |
廣泛糜爛 | 4 |
B．白細(xì)胞浸潤(rùn)（每個(gè)高倍視野） | |
無 | 0 |
極少 ＜25個(gè) | 1 |
輕度 26~50個(gè) | 2 |
中度 51~100個(gè) | 3 |
重度 ＞100個(gè) | 4 |
C．血管充血 | |
無 | 0 |
極少 | 1 |
輕度 | 2 |
中度 | 3 |
重度伴血管破裂 | 4 |
D．水腫 | |
無 | 0 |
極少 | 1 |
輕度 | 2 |
中度 | 3 |
重度 | 4 |
刺激反應(yīng)積分=A+B+C+D
2.3.5.4操作程序
(1)稀釋使用的**劑采用黏膜**時(shí)應(yīng)用液5倍濃度的溶液作為受試液。若應(yīng)用液為原液的**劑則用原液作受試液。對(duì)照組采用生理鹽水。
(2)將長(zhǎng)度為8cm左右的鈍頭軟管與2ml的注射器連接。注射器和導(dǎo)管注滿受試液備用。每只動(dòng)物各準(zhǔn)備一套。
(3)一次**黏膜刺激試驗(yàn)的染毒方法：將動(dòng)物仰面固定，暴露出會(huì)陰和**口。將導(dǎo)管用受試液或?qū)φ找簼駶?rùn)后輕柔地插入**（4cm~5cm），并用注射器緩慢注入2ml受試液，抽出導(dǎo)管，完成染毒。對(duì)照組動(dòng)物用生理鹽水作同樣處理。
(4)多次**黏膜刺激試驗(yàn)的染毒方法：按上述2.3.5.4（3））的染毒方法，每隔24h重復(fù)染毒一次，連續(xù)5d。對(duì)照組動(dòng)物用生理鹽水作同樣處理。
(5)由于動(dòng)物**容積的個(gè)體差異，有時(shí)受試液注入后可能有溢出，可用**棉或軟紙拭去。
(6)末次染毒后24h，采用氣栓法處死動(dòng)物，剖腹取出完整的**，縱向切開，肉眼觀察是否有充血、水腫等表現(xiàn)，供病理取材時(shí)參考。然后將**放入10%福爾馬林溶液中固定24h以上，選取**的兩端和中央3個(gè)部位的組織制片，HE染色后，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。
2.3.3.5結(jié)果評(píng)價(jià)
(1)組織病理學(xué)檢查結(jié)果，按表2-16規(guī)定對(duì)**黏膜的刺激反應(yīng)進(jìn)行評(píng)分。
(2)將試驗(yàn)組3只動(dòng)物3個(gè)部位的刺激反應(yīng)積分相加后，再除以觀察總數(shù)（動(dòng)物數(shù)×3），得出試驗(yàn)組**黏膜刺激反應(yīng)的平均積分，*大記分為16（見表2-16）。對(duì)照組評(píng)分方法同上。
(3)將試驗(yàn)組平均積分減去對(duì)照組平均積分得出刺激指數(shù)后，按表2-17進(jìn)行刺激強(qiáng)度分級(jí)。
(4)當(dāng)對(duì)照組動(dòng)物**黏膜刺激反應(yīng)平均積分大于9時(shí)，應(yīng)采用6只動(dòng)物進(jìn)行復(fù)試，以鑒別是否與操作損傷有關(guān)。
表2-17 **黏膜刺激強(qiáng)度分級(jí)
**黏膜刺激指數(shù) | **黏膜刺激反應(yīng)強(qiáng)度 |
＜1 | 無 |
1~＜5 | 極輕 |
5~＜9 | 輕度 |
9~＜12 | 中度 |
≥12 | 重度 |
2.3.6 皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)
2.3.6.1 目的
檢測(cè)**劑重復(fù)接觸后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生皮膚變態(tài)反應(yīng)的可能性及其強(qiáng)度。
2.3.6.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
選用皮膚完好的健康白色豚鼠，雌雄各半，體重200g～300g。
2.3.6.3 試驗(yàn)分組
將豚鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組，每組動(dòng)物至少16只。
2.3.6.4 操作程序
(1)對(duì)試驗(yàn)組豚鼠，給予受試物誘導(dǎo)和激發(fā)處理。陽性對(duì)照組給予陽性致敏物(如：2，4-二硝基氯苯)誘導(dǎo)和激發(fā)處理。陰性對(duì)照組僅給以受試物激發(fā)處理。
(2)誘導(dǎo)處理濃度允許引起皮膚輕度刺激反應(yīng)。激發(fā)濃度低于誘導(dǎo)濃度，不得引起原發(fā)性刺激反應(yīng)。如果原液不引起皮膚刺激反應(yīng)，誘導(dǎo)和激發(fā)均使用原液。
(3)于試驗(yàn)前24h將豚鼠背部左側(cè)3cm×3cm范圍內(nèi)去毛。取誘導(dǎo)濃度的**劑溶液(或原液)0.5ml（g），直接涂在2cm×2cm左側(cè)去毛皮膚上或滴于同樣大小的2層～4層紗布上，再將其敷貼在左側(cè)去毛區(qū)。用一層無刺激塑料膜或油紙復(fù)蓋，再以無刺激膠布固定，持續(xù)6h。第 7d和第 14d以同樣方法重復(fù)一次。
(4)在末次誘導(dǎo)后14d，將激發(fā)濃度的**劑溶液0.5ml（g）直接涂在2cm×2cm右側(cè)脫毛皮膚上或滴于同樣大小的2層～4層紗布上，敷貼于豚鼠背部右側(cè)3cm×3cm去毛區(qū)。然后，用一層塑料膜或油紙和無刺激膠布固定，6h后將敷貼的受試物洗去。24h和48h后觀察皮膚反應(yīng)，按表2-17對(duì)皮膚反應(yīng)評(píng)分。
(5)實(shí)驗(yàn)室開展皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)初期，或使用新的動(dòng)物種屬或品系時(shí)，需同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照組，陽性對(duì)照物可使用2，4-二硝基氯代苯。為保證試驗(yàn)方法的可靠性，在進(jìn)行該類試驗(yàn)時(shí)，每隔半年應(yīng)使用陽性對(duì)照物檢查一次。若檢測(cè)報(bào)告中需用非本次陽性對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)時(shí)，應(yīng)注明其實(shí)驗(yàn)日期。陽性對(duì)照組的操作程序同試驗(yàn)組，以陽性致敏物替代受試物。
(6)陰性對(duì)照組，僅對(duì)動(dòng)物給予受試物的激發(fā)接觸，每次試驗(yàn)必須設(shè)置。
2.3.6.5 評(píng)價(jià)規(guī)定
化學(xué)物質(zhì)引起的過敏性接觸性皮炎，屬遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。對(duì)于動(dòng)物，僅見皮膚紅斑和水腫。
根據(jù)表2-18標(biāo)準(zhǔn)，將出現(xiàn)皮膚反應(yīng)(評(píng)分≥1)的動(dòng)物數(shù)除以該組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)，求得致敏率(%)，按表2-1**定致敏強(qiáng)度。
表2-18 皮膚反應(yīng)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
皮膚反應(yīng) 評(píng)分
A 紅斑形成:
無紅斑 0
輕微紅斑 1
中度紅斑 2
嚴(yán)重紅斑 3
水腫性紅斑 4
B 水腫形成:
無水腫 0
輕度水腫 1
中度水腫 2
嚴(yán)重水腫 3
表2-19 致敏強(qiáng)度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)
致敏率(%) 致敏強(qiáng)度
0～8 極輕度
9～28 輕度
29～64 中度
65～80 強(qiáng)度
81～100 極強(qiáng)度
注：致敏率為0%時(shí)，可判為未見皮膚變態(tài)反應(yīng)。
2.3.7 亞急性毒性試驗(yàn)
2.3.7.1 目的
(1)檢測(cè)**劑多次接觸對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的蓄積毒性作用及其靶器官，并確定其*大未觀察到有害作用劑量和*小觀察到有害作用劑量。
(2)為亞慢性、慢性毒性或致癌試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)提供依據(jù)。
2.3.7.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
一般用嚙齒類動(dòng)物，優(yōu)選大鼠。所用大鼠應(yīng)為 6周齡～8 周齡，每組至少10只，雌雄各半。
2.3.7.3 試驗(yàn)分組
將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組(3個(gè)劑量組和1個(gè)對(duì)照組)。選擇受試物劑量時(shí)，高劑量組應(yīng)出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)，但不引起死亡，如果出現(xiàn)動(dòng)物死亡應(yīng)不超過10%；中間劑量組應(yīng)可觀察到輕微的毒性效應(yīng)；低劑量組應(yīng)不引起任何毒性效應(yīng)(屬未觀察到有害作用劑量)。至于具體的劑量設(shè)計(jì)，可考慮高劑量為L(zhǎng)D50的1/5~1/10，高、中、低3個(gè)劑量間的組距以3倍~5倍為宜，*低不小于2倍。對(duì)于LD50＞5000mg/Kg的**劑，高劑量應(yīng)用1000mg/Kg。另以受試物溶劑代替受試物進(jìn)行試驗(yàn)，作為陰性（溶劑）對(duì)照組。
2.3.7.4 操作程序
(1)采用灌胃方式經(jīng)口染毒。
(2)灌胃法每天灌胃一次，每周稱體重，并按體重調(diào)整受試物的給予量。
(3)試驗(yàn)期為28d~30d，末次染毒后24h檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)，然后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，做病理學(xué)檢查。
2.3.7.5 觀察指標(biāo)
可因**劑毒理作用不同而有差異，一般應(yīng)包括下列各方面。
(1)臨床檢查。觀察動(dòng)物中毒表現(xiàn)，每周稱量體重一次。
(2)血液學(xué)檢查。包括血紅蛋白含量、紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)及其分類計(jì)數(shù)等。
(3)血液生物化學(xué)檢查。例如天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、尿素氮、肌酐、血清總蛋白和白蛋白、總膽固醇等。必要時(shí)，可根據(jù)所觀察到的受試物毒性效應(yīng)，或與受試物化學(xué)結(jié)構(gòu)相似物質(zhì)的毒性作用，選擇其他一些生化指標(biāo)。
(4)臟器重量。測(cè)量肝、腎重量，并計(jì)算其臟器重量系數(shù)（臟器重 / 體重×100%）。
(5)病理學(xué)檢查。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死所有動(dòng)物，進(jìn)行**的肉眼尸檢，并將尸檢發(fā)現(xiàn)的異常組織和主要臟器和組織（如心、肺、肝、腎、脾、腦、腎上腺、睪丸、卵巢和胃腸等）固定保存。當(dāng)各劑量組動(dòng)物尸檢未發(fā)現(xiàn)明顯病變時(shí)，先進(jìn)行高劑量組和陰性對(duì)照組動(dòng)物的肝、腎、胃腸和其它可能受損的臟器的組織病理學(xué)檢查。如發(fā)現(xiàn)病變，還應(yīng)對(duì)中、低劑量組動(dòng)物相應(yīng)的器官進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。
2.3.7.6 評(píng)價(jià)規(guī)定
將各試驗(yàn)組動(dòng)物觀察指標(biāo)與陰性對(duì)照組加以比較，并進(jìn)行差異統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，注意各劑量組間的劑量-反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系。評(píng)定受試物的*小觀察到有害作用劑量和*大未觀察到有害作用劑量及毒性作用的靶器官。
2.3.8 致突變?cè)囼?yàn)
2.3.8.1 L5178Y 細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)
2.3.8.1.1 目的
檢測(cè)**劑對(duì)體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因突變作用，以作為評(píng)價(jià)**劑致突變性的依據(jù)。
2.3.8.1.2 試劑
（1）F10P培養(yǎng)液: 為完全培養(yǎng)液。以Fischer或RPMI1640培養(yǎng)液，加入馬血清10%，丙酮酸鈉220μg/ml，青霉素100IU/ml和鏈霉素100μg/ml配制而成(pH為7.2～7.4)。于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/div>
（2）F0P培養(yǎng)液:為無血清培養(yǎng)液。以Fischer或RPMI1640培養(yǎng)液，加入丙酮酸鈉220μg/ml，青霉素100 IU/ml和鏈霉素100μg/ml等配制而成(pH為7.2～7.4)。于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/div>
（3)馬血清:將過濾**后的馬血清，經(jīng)56℃作用30min滅活補(bǔ)體。分裝后，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/div>
（4)集落用培養(yǎng)基:用Fischer或RPMI1640培養(yǎng)液，加入馬血清20%、丙酮酸鈉220μg/ml、瓊脂0.37%配制而成。
（5）無鈣鎂磷酸鹽緩沖液(無鈣鎂PBS，pH為7.2～7.4):
磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0.20g
磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H2O) 2.89g
氯化鉀(KCl) 0.20g
氯化鈉(NaCl) 8.00g
雙蒸水(壓力蒸汽**) 1000ml
（6)受試物:*好能直接溶于F10P與F0P培養(yǎng)液中。否則需先溶于二甲基亞砜(DMSO)，而后再加于上述培養(yǎng)液內(nèi)。所加DMSO的量應(yīng)低于1%(V/V)。
（7)陽性對(duì)照物:選用甲基磺酸乙酯(EMS)，絲裂霉素C(MMC)，甲基硝基亞硝基胍 (MNNG)，苯并(a)芘 (BaP) 等。
（8）三氟胸苷(TFT):用生理鹽水配成100μg/ml溶液，可凍存3個(gè)月。
（9）肝微粒體酶混合液(S9 混合液):取健康的雄性成年SD或Wistar大鼠，體重150g左右，約5周齡～6周齡。將多氯聯(lián)苯(Aroclor1254)，溶于玉米油中，濃度200mg/ml，按500mg/kg體重一次腹腔注射。5d后，斷頭處死動(dòng)物，取出肝臟稱重后，用預(yù)冷的0.15mol/L氯化鉀溶液沖洗肝臟數(shù)次。每克肝(濕重)加0.15mol/L氯化鉀溶液3ml。剪碎肝臟，在冰浴中用玻璃勻漿器制成肝勻漿。以上操作需注意無菌和局部冷環(huán)境。
將肝勻漿用低溫(0℃～4℃)高速離心機(jī)，以9000g離心10min。取上清液即為S9，分裝于無菌冷凍安瓿中。S9制成后，需進(jìn)行無菌檢查，以及用間接致癌物鑒定其活性。合格者置-80℃或液氮中儲(chǔ)存?zhèn)溆?，?chǔ)存期不超過1年。
S9混合液應(yīng)以上述S9 液在臨用時(shí)按無菌要求配制。一般配成含10% S9的混合液。其配方如下：
S9 0.10ml
1.65mo1/L氯化鉀 + 0.4 mol/L氯化鎂 0.04ml
葡萄糖-6-磷酸.2Na 1.8mg
氧化型輔酶 II(NADP) 3.1mg
用F0P培養(yǎng)液補(bǔ)足至 1.0ml
2.3.8.1.3 細(xì)胞
試驗(yàn)以小鼠**瘤L5178Y細(xì)胞[胸苷激酶(TK) 座位為雜合子 (tk+/tk-)] 檢測(cè) TK基因的突變。為減少細(xì)胞的自發(fā)突變率，在制備該細(xì)胞試驗(yàn)用懸液時(shí)，先將其在加有 THMG 的 F10P培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h，殺滅培養(yǎng)液中所存在的自發(fā)突變細(xì)胞 (tk-/tk-)，然后將細(xì)胞懸浮于THG 培養(yǎng)液(不含氨甲喋呤的 THMG培養(yǎng)液)中培養(yǎng) 1d～3d。
[THMG 含下列4種成分，各成分的終末濃度如下:
胸苷 5×10-6mol/L
次黃嘌呤 5×10-5 mol/L
氨甲喋呤 4×10-7 mol/L
甘氨酸 1×10-4 mol/L]
2.3.8.1.4 試驗(yàn)分組
一般設(shè)4個(gè)劑量組。對(duì)有細(xì)胞毒性的受試物，*高劑量組的細(xì)胞存活率為10%～20%，無細(xì)胞毒性受試物*高劑量不超過10mmol/L或5mg/ml。同時(shí)應(yīng)有陰性（溶劑）對(duì)照組、未處理對(duì)照組和陽性對(duì)照組。除未處理對(duì)照組外，試驗(yàn)組和其它對(duì)照組，還均應(yīng)包括有加S9混合液和不加S9 混合液兩大部分。
2.3.8.1.5 操作程序
（1）細(xì)胞準(zhǔn)備:將新**了自發(fā)突變體的細(xì)胞群體，用F10P培養(yǎng)液制成懸液。以無菌燒瓶加入細(xì)胞懸液和F10P培養(yǎng)液至100 ml，細(xì)胞終末密度為7×103個(gè)/ml～8×103個(gè)/ml。培養(yǎng)物以含5%二氧化碳的空氣充氣后，加蓋密閉，于37℃進(jìn)行培養(yǎng)。L5178Y細(xì)胞的細(xì)胞殖周期約為10h～11h，在常規(guī)培養(yǎng)24h后，細(xì)胞數(shù)將增加約5倍。用稀釋法維持生長(zhǎng)，每天將細(xì)胞培養(yǎng)物用F10P培養(yǎng)液作4倍稀釋(或隔天用F10P培養(yǎng)液作24倍稀釋)，繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前**用F10P培養(yǎng)液和F0P 培養(yǎng)液各50% 的對(duì)半混合液(馬血清終末濃度為 5%) 稀釋。
（2)受試物處理:用上述F10P和F0P 的對(duì)半混合液將細(xì)胞培養(yǎng)物稀釋至1×106 個(gè)/ml，并分種于50ml有蓋試管中，每管6ml，再加S9混合液4ml(總量共10ml)。不加S9混合液管，代之以F0P培養(yǎng)液。在上述試管內(nèi)加入一定濃度的受試物，并以含5%二氧化碳的空氣充氣后加蓋密閉，于37℃培養(yǎng)4h。
處理結(jié)束后，以200g離心10min，除去含受試物的上清液，收集細(xì)胞。細(xì)胞用Hanks液洗滌，再加入20mlF10P培養(yǎng)液充分混懸(細(xì)胞濃度為0.3×l06 個(gè)/ml)，以含 5%二氧化碳的空氣充氣后，加蓋密閉，于37℃ 振蕩培養(yǎng)，開始表達(dá)。
（3）表達(dá):細(xì)胞的表現(xiàn)型表達(dá)時(shí)間為2d。表達(dá)開始后24和48h經(jīng)計(jì)數(shù)后將細(xì)胞稀釋至3 ×105 個(gè)/ml。
（4）選擇和集落化:表達(dá)結(jié)束后，取10ml培養(yǎng)物經(jīng)離心后除去大部分上清液。并將細(xì)胞在留下的約1mlF10P培養(yǎng)基中混懸。將細(xì)胞懸液移入含100ml集落培養(yǎng)基的燒瓶中。此時(shí)細(xì)胞密度為3×l04個(gè)/ml。在37℃振蕩培養(yǎng) 30min。取出 0.5ml后，向余下的細(xì)胞懸液中加入 1.0ml TFT 貯存液，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)15min。將樣本取出，倒于3個(gè)10cm平皿中，每平皿33ml，含1×l06個(gè)細(xì)胞(稱為TFT平板)，作突變體的選擇。將先前取出的0.5ml細(xì)胞懸液用集落培養(yǎng)基先作1:100稀釋，細(xì)胞懸液濃度為3×l02個(gè)/ml。振蕩培養(yǎng)15min 后，取出2.0ml 再用集落培養(yǎng)基作 1:50 稀釋(此時(shí)細(xì)胞懸液濃度為 6個(gè)/ml) 后振蕩培養(yǎng)。經(jīng)15min培養(yǎng)后，倒入3個(gè)直徑為100mm的平皿中，每平皿33ml，含細(xì)胞200個(gè)(稱為VC平板)。待瓊脂凝固后，置二氧化碳培養(yǎng)箱(37℃)中靜置培養(yǎng)10d。計(jì)數(shù)各個(gè)平皿中出現(xiàn)的集落數(shù)，計(jì)算集落形成效率(CFE)。
（5)陽性與陰性對(duì)照組的操作程序同試驗(yàn)組，僅陽性對(duì)照組用陽性對(duì)照物代替受試物，陰性(溶劑)對(duì)照組用受試物溶劑代替受試物。另設(shè)一未處理對(duì)照組。
（6)按下列公式計(jì)算有關(guān)指標(biāo):
**CFE = (形成集落數(shù) / 接種細(xì)胞數(shù))
相對(duì)CFE = (試驗(yàn)組**CFE / 溶劑對(duì)照組**CFE) × 100%
突變頻率(MF) = (TFT平皿集落數(shù) / VC平皿集落數(shù)) × 稀釋系數(shù)
（在此，稀釋系數(shù)為 2×l0-4）。
2.3.8.1.6 評(píng)價(jià)規(guī)定
（1）對(duì)L5178Y 細(xì)胞，推薦可接受的自發(fā)突變頻率范圍為20/106～100/106個(gè)存活細(xì)胞。
（2）用適當(dāng)?shù)娘@著性檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，當(dāng)各劑量組MF與陰性(溶劑)對(duì)照組者相比突變率，有顯著性意義的增加，并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系時(shí)，或僅一個(gè)劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加并經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)者，均可判為陽性結(jié)果，即受試物對(duì)L5178Y細(xì)胞 TK 系統(tǒng)有致突變性。
2.3.8.2 V79 細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)
2.3.8.2.1 目的
檢測(cè)**劑對(duì)體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可否引起基因突變，以對(duì)**劑的致突變性做出評(píng)價(jià)。
2.3.8.2.2 試劑
（1）完全培養(yǎng)液：以Eagle*低必需培養(yǎng)液(EMEM)或RPMI1640培養(yǎng)液加10%小牛血清、青霉素 (100IU/ml) 和鏈霉素 (100μg/ml) 配制而成。
（2)小牛血清:將過濾**后的小牛血清放入56℃水浴中，保溫30min以滅活補(bǔ)體，而后分裝，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/div>
（3）無鈣鎂磷酸鹽緩沖液(無鈣鎂PBS):見2.3.8.1.2（5）。
（4)胰蛋白酶-EDTA溶液:分別用無鈣鎂 PBS 配制胰蛋白酶與EDTA溶液，胰蛋白酶溶液濃度為0.05%，EDTA溶液濃度為0.02%。兩溶液按1:1混合。存放于-20℃ 備用。
（5)受試物:*好能直接溶于無血清培養(yǎng)液內(nèi)。否則，需先溶于二甲基亞砜(DMSO)，而后加于無血清培養(yǎng)液內(nèi)。所加DMSO溶液量為0.5%(V/V)。
（6)陽性對(duì)照物:可根據(jù)受試物的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)選用不同的陽性對(duì)照物，例如甲基磺酸乙酯(EMS)，絲裂霉素C(MMC)，甲基硝基亞硝基胍(MNNG)，苯并(α)芘(BaP)等。
（7)6-硫代鳥嘌呤(6-TG): 用0.5% 碳酸氫鈉溶液配制為1.0mg/mL 溶液，保存于4℃?zhèn)溆谩?/div>
（8）肝微粒體酶混合液(S9混合液):見2.3.8.1.2 （9）。
（9）姬姆薩染液: 取姬姆薩染料3.8g，置瑪瑙乳缽中，加少量甲醇研磨。逐漸加甲醇至375ml，待完全溶解后，再加125ml甘油，放入37℃溫箱中保溫48h。保溫期間振搖數(shù)次，使充分溶解。取出過濾，2周后使用，作為姬姆薩染液原液。
使用時(shí)，取1份姬姆薩染液原液，與9份1/15mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8) 混合，配成其應(yīng)用液。
磷酸鹽緩沖液(1/15mol/L，pH6.8)配制方法如下:
**液:取磷酸氫二鈉9.47g溶于蒸餾水1000ml中，配成1/15mol/L溶液。
**液:取磷酸二氫鉀49.07g溶于蒸餾水1000ml中，配成1/15mol/L溶液。
取**液49.5ml加于**液50.5ml中混勻，即為pH6.8的1/15mol/LPBS。
2.3.8.2.3 細(xì)胞
以中國(guó)倉鼠肺(V79)細(xì)胞株進(jìn)行試驗(yàn)。為減少其自發(fā)突變，正式試驗(yàn)前將野生型細(xì)胞接種于含THMG(見2.3.8.1.3)的MEM培養(yǎng)液內(nèi)并在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周，以殺滅自發(fā)HGPRT位點(diǎn)突變體。遂后重新接種于MEM培養(yǎng)液中。
2.3.8.2.4 試驗(yàn)分組
一般設(shè)4個(gè)試驗(yàn)劑量組。對(duì)有細(xì)胞毒性的受試物，*高劑量組的細(xì)胞存活率為10%～20%，無細(xì)胞毒性受試物*高劑量不超過10mmol/L(或5mg/ml)。同時(shí)，應(yīng)設(shè)陰性（溶劑）對(duì)照組、未處理對(duì)照組和陽性對(duì)照組。除未處理對(duì)照組外，各組均應(yīng)包括加S9混合液和不加該液的樣本。
2.3.8.2.5 操作程序
（1）細(xì)胞準(zhǔn)備:將5×105個(gè)細(xì)胞接種于含完全培養(yǎng)液的直徑為100mm的平皿中，除未處理對(duì)照組外，每組2皿共13皿。于二氧化碳培養(yǎng)箱中(37℃)培養(yǎng)24h。
(2)接觸受試物：吸去上述供試培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，用無鈣鎂PBS洗2次。將含有細(xì)胞的培養(yǎng)皿分為二大組，一組加S9混合液，另一組不加S9混合液。加S9混合液組，在培養(yǎng)皿中加入2mlS9混合液，對(duì)不加S9混合液組，則用2ml無血清培養(yǎng)液代替，再加一定量不同濃度受試物的供試液，*后用不含血清的培養(yǎng)液補(bǔ)足至10ml。并將培養(yǎng)皿置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5h，處理結(jié)束后，吸去培養(yǎng)皿中液體部分，用無鈣鎂PBS洗滌細(xì)胞2次，再加入完全培養(yǎng)液10ml，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)19h~22h。陽性和陰性(溶劑)對(duì)照組也分加與不加S9混合液兩大組，操作方法同上。
(3)表達(dá)：將培養(yǎng)物用胰蛋白酶-EDTA消化。待細(xì)胞脫落后，加入完全培養(yǎng)液，終止消 化?；靹?、計(jì)數(shù)并進(jìn)行表達(dá)和細(xì)胞毒性測(cè)定[見2.3.8.2.5（4)]。表達(dá)時(shí)，以5×105 個(gè)細(xì)胞接種于直徑為100mm的平皿中。培養(yǎng)3天后，分傳一次，仍接種5×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)3天后再進(jìn)行突變體的選擇及集落形成效率(CFE)的測(cè)定。
(4)細(xì)胞毒性測(cè)定:將上述消化計(jì)數(shù)后的細(xì)胞，每平皿接種200個(gè)，每組5個(gè)平皿，于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)(37℃)培養(yǎng)7d。取出樣本，固定并進(jìn)行姬姆薩染色后，計(jì)數(shù)各平皿的細(xì)胞集落數(shù)。以相對(duì)CFE值表示細(xì)胞的毒性。
(5)突變體的選擇及集落形成率的測(cè)定: 表達(dá)結(jié)束后，消化細(xì)胞，分別接種，每組5個(gè)平皿，每平皿種2×105個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后加入 6-TG，終末濃度為5μg/ml。放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d～10d。固定后進(jìn)行姬姆薩染色，計(jì)數(shù)平皿內(nèi)集落數(shù)，并計(jì)算其突變頻率(MF)。
(6)陽性與陰性對(duì)照組的操作程序同試驗(yàn)組，僅陽性對(duì)照組用陽性對(duì)照物代替受試物，陰性(溶劑)對(duì)照組用受試物溶劑代替受試物。另設(shè)一陰性(未處理)對(duì)照組。
(7)按下列公式計(jì)算有關(guān)指標(biāo):
** CFE =(形成集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))
相對(duì)CFE = (試驗(yàn)組**CFE/溶劑對(duì)照組**CFE) × 100%
突變頻率(MF) = (突變集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)) ×（1/**CFE）
2.3.8.2.6 評(píng)價(jià)規(guī)定
(1)對(duì)V79細(xì)胞，推薦可接受的自發(fā)突變頻率范圍為10/106～100/106個(gè)存活細(xì)胞。
(2)用適當(dāng)?shù)娘@著性檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，當(dāng)各劑量組MF與陰性(溶劑)對(duì)照組者相比，突變率有顯著性意義的增加，并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系時(shí)，或僅一個(gè)劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加并經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)者，均可判為陽性結(jié)果，即受試物對(duì)V79 細(xì)胞 HGPRT 系統(tǒng)有致突變性。
2.3.8.3 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)
2.3.8.3.1 目的
用細(xì)胞遺傳學(xué)方法檢測(cè)體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變，評(píng)價(jià)**劑的致突變性。
2.3.8.3.2 試劑
(1)完全培養(yǎng)液: 采用 Eagle*低必需培養(yǎng)液(EMEM)或Dulbecco *低必需培養(yǎng)液 (DMEM)等，并加入 10%小牛血清以及青霉素(100IU/ml) 和鏈霉素(100μg/ml)。
(2)小牛血清:將過濾**后的小牛血清，放人56℃恒溫水浴中，保溫30min滅活補(bǔ)體。處理后分裝，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/div>
(3)無鈣鎂磷酸緩沖液[無鈣鎂PBS，pH為7.2～7.4。見2.3.8.1.2（5)]。
(4)胰蛋白酶-EDTA:見2.3.8.2.2（4）。
(5)受試物:*好能直接溶于無血清完全培養(yǎng)液內(nèi)。否則，需先溶于二甲基亞砜(DMSO)，而后加于完全培養(yǎng)液內(nèi)。所加DMSO溶液量應(yīng)低于1.0%(V/V)。
(6)陽性對(duì)照物：加S9時(shí)選用環(huán)磷酰胺等，不加S9時(shí)選用絲裂霉素C等。
(7)肝微粒體酶混合液(S9混合液):見2.3.8.1.2（9)。
(8)秋水仙素溶液(0.04%)：取40mg秋水仙素溶解于100ml無菌0.85%氯化鈉溶液中，過濾**。
(9)氯化鉀溶液(0.075mol/L)。
(10)甲醇/冰醋酸(3:1，V/V) 固定液: 臨用現(xiàn)配。
(11)姬姆薩染液:見2.3.8.2.2（9)。
2.3.8.3.3 細(xì)胞
可選用中國(guó)倉鼠肺（CHL）細(xì)胞、中國(guó)倉鼠肺 （V79） 細(xì)胞、中國(guó)倉鼠卵巢 （CHO）細(xì)胞，或人外周血**細(xì)胞等進(jìn)行試驗(yàn)。
在一般情況下，本試驗(yàn)推薦使用CHL細(xì)胞。 使用CHL 細(xì)胞時(shí)，在試驗(yàn)前**，將其1×l06個(gè)細(xì)胞接種于直徑為100mm平皿中，置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)待用。
2.3.8.3.4 試驗(yàn)分組
所設(shè)試驗(yàn)劑量組應(yīng)不少于4個(gè)。*高劑量組的細(xì)胞存活率應(yīng)為10%～20%，無毒性受試 物*高劑量組不超過10mmol/L(或5mg/ml)。同時(shí)，應(yīng)設(shè)陰性(溶劑)對(duì)照組、未處理對(duì)照組和陽性對(duì)照組。除未處理對(duì)照組外，各組均應(yīng)包括加S9混合液和不加該液的樣本。
2.3.8.3.5 操作程序
(1)試驗(yàn)時(shí)，吸出細(xì)胞培養(yǎng)平皿中的培養(yǎng)液，加入試驗(yàn)所規(guī)定濃度的受試物和S9混合物(10%)以及不含小牛血清的完全培養(yǎng)液，放二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)作用2h。結(jié)束后，吸去完全培養(yǎng)液，用Hanks液洗細(xì)胞3次。加完全培養(yǎng)液，再置二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于24h收獲細(xì)胞。收獲細(xì)胞之前2h～4h，加入秋水仙素溶液(終末濃度為1μg/ml)，阻斷細(xì)胞于有絲分裂中期相。
(2)收獲細(xì)胞時(shí)，用胰蛋白酶-EDTA溶液消化細(xì)胞，待細(xì)胞脫落，加入培養(yǎng)液并混勻 以終止胰蛋白酶作用。離心(1000r/min～1200r/min，5min～7min)，棄去上清液后，加入0.075mol/L氯化鉀溶液低滲處理10min～20min。離心后，再以甲醇/冰醋酸液固定2次。按常規(guī)滴片干燥，用姬姆薩應(yīng)用液染色15min 左右。
(3)陽性與陰性對(duì)照組的操作程序同試驗(yàn)組，只是陽性對(duì)照組用已知染色體斷裂劑替代受試物。陰性(溶劑)對(duì)照組用受試物的溶劑。另設(shè)一未處理對(duì)照組。
(4)觀察：每組各選100個(gè)染色體分散良好的中期分裂相細(xì)胞，進(jìn)行染色體畸變分析，觀察和記錄染色體結(jié)構(gòu)的異常及數(shù)量異常。
染色體結(jié)構(gòu)異?？捎校簲嗔?，微小體，有著絲點(diǎn)環(huán)，無著絲點(diǎn)環(huán)，單體互換，雙微小體，裂隙，非特定性型變化(粉碎化等)。染色體數(shù)量異?？捎?非整倍體，多倍體，內(nèi)復(fù)制。
2.3.8.3.6 評(píng)價(jià)規(guī)定
用χ2檢驗(yàn)或其他適當(dāng)?shù)娘@著性檢驗(yàn)方法，對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。當(dāng)各劑量組與陰性(溶劑)對(duì)照組相比，畸變細(xì)胞率的增加有顯著性意義，并有劑量-反應(yīng)關(guān)系時(shí)； 或僅一個(gè)劑量組有顯著性意義的增加，并經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)時(shí)，可判為該受試物在本試驗(yàn)中具有致突變性。
2.3.8.4 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)
2.3.8.4.1 目的
檢測(cè)**劑對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核形成的影響，評(píng)價(jià)**劑的染色體損傷毒性。
2.3.8.4.2 試劑
(1)受試物: 用水、植物油或用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成溶液或混懸液。
(2)陽性對(duì)照物: 常用環(huán)磷酰胺或絲裂霉素C。
(3)小牛血清:見2.3.8.3.2（2）。
(4)姬姆薩染液:見2.3.8.2.2（9）。
2.3.8.4.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
選用體重為25g～30g的小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分組。
2.3.8.4.4 試驗(yàn)分組
受試物至少設(shè)3個(gè)劑量組，每個(gè)劑量組用10只動(dòng)物，雌雄各半。另設(shè)陰性(溶劑)和陽性對(duì)照組。劑量組一般取受試物的1/2LD50、1/5LD50、1/20LD50等劑量，以得到劑量-反應(yīng)關(guān)系。高劑量組應(yīng)不引起動(dòng)物死亡，不引起明顯骨髓抑制。若采用一次*大限度試驗(yàn)測(cè)得LD50大于5000mg/kg體重，即以5000mg/kg體重為高劑量。
2.3.8.4.5 操作程序
(1)動(dòng)物染毒采用經(jīng)口灌胃30h 染毒法，即兩次染毒間隔24h，**次染毒后6h取材。
(2)用頸椎脫臼法處死動(dòng)物，取股骨或胸骨。剝除肌肉，擦凈血污。切斷股骨或胸骨兩端，暴露骨髓腔。
(3)用注射器吸取0.1ml小牛血清，沖洗骨髓腔。用沖洗液常規(guī)涂片，晾干或熱風(fēng)吹干。
(4)將已干的涂片，在甲醇中固定5min～10min。用姬姆薩應(yīng)用液染色10min～15min，然后用pH6.8PBS液沖洗，晾干。
(5)陽性與陰性對(duì)照組的操作程序同試驗(yàn)組。陽性組選用環(huán)磷酰胺(40mg/kg體重)或絲裂霉素(1mg/kg～1.5mg/kg體重)。陰性(溶劑)對(duì)照組用受試物溶劑。
(6)選擇細(xì)胞分布均勻、完整、著色適當(dāng)?shù)膮^(qū)域。在油鏡下計(jì)數(shù)含微核的嗜多染紅細(xì)胞（PCE）數(shù)。PCE呈灰藍(lán)色[成熟紅細(xì)胞(NCE)呈粉紅色]，微核多呈圓形、邊緣光滑、整齊，嗜色性與有核細(xì)胞核質(zhì)一致，呈紫紅色或藍(lán)紫色。直徑通常為紅細(xì)胞的1/20～1/5。
(7)每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)PCE。微核細(xì)胞率指含有微核的PCE數(shù)，以千分率表示。1個(gè)PCE中出現(xiàn)有2個(gè)或多個(gè)微核，仍按1個(gè)計(jì)數(shù)。此外，還應(yīng)觀察PCE/NCE比例，作為對(duì)細(xì)胞毒性的指標(biāo)。一般計(jì)數(shù)200個(gè)PCE，同時(shí)記數(shù)所見到的NCE。當(dāng)PCE/NCE小于0.1時(shí)，提示對(duì)骨髓具有明顯抑制作用，應(yīng)降低受試物劑量，重新進(jìn)行試驗(yàn)。
2.3.8.4.6 評(píng)價(jià)規(guī)定
陰性對(duì)照組小鼠，微核細(xì)胞率一般不超過0.3%。
用波松分布 u檢驗(yàn)或其他適當(dāng)?shù)娘@著性試驗(yàn)方法，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。當(dāng)各劑量組與溶劑對(duì)照組相比，微核細(xì)胞率的增加有顯著性意義，并有劑量-反應(yīng)關(guān)系，或僅一個(gè)劑量組微核細(xì)胞率增加有顯著性意義，并經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)時(shí)，均可判為受試物具有體內(nèi)染色體損傷作用。
2.3.8.5 哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)
2.3.8.5.1 目的
用細(xì)胞遺傳學(xué)方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體畸變率，以評(píng)價(jià)**劑的致突變性。
2.3.8.5.2 試劑
(1)陽性對(duì)照物: 常用環(huán)磷酰胺，絲裂霉素C等。
(2)秋水仙素(0.04%):取40mg秋水仙素溶解于100ml無菌的0.85% 氯化鈉溶液中，過濾**。
(3)氯化鉀溶液(0.075mol/L)。
(4)甲醇/冰醋酸(3:1，V/V)固定液:臨用現(xiàn)配。
(5)姬姆薩染液[見2.3.8.2.2（9)]。
(6)磷酸鹽緩沖液(PBS，1/15mol/L，pH7.4)。
2.3.8.5.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
成年小鼠(體重25g～30g)，或大鼠(體重180g～220g)。動(dòng)物總數(shù)不少于30只，雌雄各半。
2.3.8.5.4 試驗(yàn)分組
隨機(jī)分為5組。至少3個(gè)受試物劑量組，為1/2LD50、1/5LD50、1/20LD50。若采用一次*大限度試驗(yàn)，測(cè)得LD50大于5000mg/kg體重，即以5000mg/kg體重為高劑量。另設(shè)陽性對(duì)照組和陰性(溶劑)對(duì)照組，每組6只動(dòng)物，雌雄各半。陽性對(duì)照組可用環(huán)磷酰胺(40mg/kg體重)或絲裂霉素C(1.5mg/kg～2mg/kg體重)。陰性(溶劑)對(duì)照組采用受試物溶劑。
2.3.8.5.5 操作程序
(1)用經(jīng)口灌胃方式，共染毒兩次，間隔24h。于**次染毒后6h處死動(dòng)物。處死動(dòng)物前2h～4h腹腔注射0.04%秋水仙素溶液，劑量為4mg/kg體重。
(2)用頸椎脫臼法處死動(dòng)物，取出股骨，剔除肌肉等組織。
(3)剪去股骨兩端，用注射器吸取5ml生理鹽水，從股骨一端注入，用10ml離心管從股骨另一端接取流出的骨髓細(xì)胞懸液。
(4)將骨髓細(xì)胞懸液離心(1000r/min，5min～7min)，除上清液。加0.075mol/L氯化鉀溶液7m1，用滴管將細(xì)胞輕輕混勻，置37℃水浴中低滲處理7min。
(5)加入2ml甲醇/冰醋酸固定液，混勻。離心(1000r/min，5min～7min)，棄上清液。再加入7ml固定液，混勻，固定7min。離心(1000r/min，7min)，棄去上清液。
(6)用同法再固定1次～2次，棄上清液，加入數(shù)滴新鮮固定液，混勻。
(7)用懸液滴片，晾干，以姬姆薩應(yīng)用液染色。
(8)每組各選100個(gè)染色體分散良好的中期分裂相細(xì)胞，進(jìn)行染色體畸變分析，觀察和記錄染色體結(jié)構(gòu)的異常和數(shù)量的異常。染色體結(jié)構(gòu)異常可有:斷裂、微小體、有著絲點(diǎn)環(huán)、單體互換、雙微小體、裂隙、粉碎化等。染色體數(shù)量的異常可有:非整倍體、多倍體、內(nèi)復(fù)制等。
(9)計(jì)算畸變細(xì)胞率。畸變細(xì)胞率為100個(gè)中期分裂相細(xì)胞中有染色體畸變的細(xì)胞數(shù)。一個(gè)中期分裂相細(xì)胞出現(xiàn)兩種或多種畸變，仍按一個(gè)有染色體畸變細(xì)胞計(jì)。
(10)陽性與陰性(溶液)對(duì)照組的操作程序同試驗(yàn)組。只是陽性組選用環(huán)磷酰胺(40mg/kg 體重)或絲裂霉素(1.5mg/kg～2.0mg/kg體重)作為受試物的替代物。陰性(溶劑)對(duì)照組用受試物溶劑作為受試物的替代物。
2.3.8.5.6 評(píng)價(jià)規(guī)定
用χ2檢驗(yàn)或其他適當(dāng)?shù)娘@著性檢驗(yàn)方法對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。當(dāng)各劑量組與陰性(溶劑)對(duì)照組相比，畸變細(xì)胞率的增加有顯著性意義，并有劑量-反應(yīng)關(guān)系時(shí)；或僅一個(gè)劑量組畸變細(xì)胞率增加有顯著性意義，并經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)時(shí)，可判為該受試物在本試驗(yàn)中具有致突變性。
2.3.8.6 程序外DNA修復(fù)合成試驗(yàn)
2.3.8.6.1 目的
檢測(cè)受試物是否可引起體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞的原發(fā) DNA 損傷。推薦用放射自顯影法進(jìn)行測(cè)定。
2.3.8.6.2 試劑
(1)完全培養(yǎng)液:用Eagle*低要求培養(yǎng)基(EMEM)85份加小牛血清15 份，青霉素(終末濃度100IU/ml)與鏈霉素(終末濃度100μg/mL)，pH為7.2～7.4。過濾**后，保存于4℃冰箱備用。
(2）同步培養(yǎng)液:用不含精氨酸的EMEM培養(yǎng)基 98 份，加小牛血清 2份，再加青霉素(終末濃度100IU/ml)與鏈霉素(終末濃度為100μg/mL)配制而成。
(3）小牛血清:見3.11.2.2 2)。
(4）無鈣鎂磷酸鹽緩沖液(無鈣鎂PBS):見2.3.8.1.2（5）。
(5）胰蛋白酶-EDTA溶液:見2.3.8.2.2（4）。
(6）甲醇/冰醋酸(3:1，V/V) 固定液:臨用現(xiàn)配。
(7）羥基脲(HU)貯備液:250mmol/L。
(8）1% 枸櫞酸鈉溶液。
(9）3H-胸腺嘧啶核苷
(10）NTB-2 核乳膠或國(guó)產(chǎn)核-4乳膠。
(11）肝微粒體酶混合液(S-9混合液):見2.3.8.1.2（9）。
(12)顯影液及定影液:包括柯達(dá)(Kodak)D-196顯影液、停顯液及 F-5 定影液。
2.3.8.6.3 細(xì)胞
可選用人成纖維細(xì)胞、大鼠原代肝細(xì)胞、外周血**細(xì)胞等進(jìn)行試驗(yàn)。本規(guī)范推薦使用人胚肺成纖維細(xì)胞(2BS)。
2.3.8.6.4 試驗(yàn)分組
受試物可設(shè)4個(gè)劑量組。*高劑量組應(yīng)使細(xì)胞存活率在10%～20%之間。無毒性受試物*高劑量不超過10mmol/ml。同時(shí)應(yīng)有陰性(未處理、溶劑) 對(duì)照組和陽性對(duì)照組。
2.3.8.6.5 操作程序
人胚肺成纖維細(xì)胞(2BS)放射自顯影法操作程序。
(1)將細(xì)胞增殖至所需數(shù)量后，用完全培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，濃度為0.5×105個(gè)/ml～1.0×105個(gè)/ml。將細(xì)胞懸液接種置有小蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1d～3d，至細(xì)胞50%融合。每一劑量組和各對(duì)照組分別作2個(gè)～3個(gè)平行樣本。
(2)換用同步培養(yǎng)液，培養(yǎng) 3d。
(3)在試驗(yàn)的前一日下午，加入羥基脲(HU)貯備液使HU的終末濃度為10mmol/L。繼續(xù)在37℃下培養(yǎng)16h，然后將上述長(zhǎng)有細(xì)胞之蓋片置于含有不同濃度的受試物、HU(10mmol/L)及3H -胸腺嘧啶核苷(5μCi/ml～10μCi/ml，30Ci/mmol)同步培養(yǎng)液中。在37℃培養(yǎng)5h。
(4)陽性及陰性對(duì)照組的操作程序同試驗(yàn)組，只是陽性對(duì)照組用陽性對(duì)照物代替受試物，陰性(溶劑)對(duì)照組用受試物溶劑代替受試物。
(5)處理結(jié)束后，用Hanks液洗滌3次，再用1%枸掾酸鈉溶液處理10min。將小蓋玻片用甲醇-冰醋酸固定液固定30min，重復(fù)2次。干燥過夜，將有細(xì)胞的蓋玻片用少量中性樹膠，粘固于載玻片上，長(zhǎng)有細(xì)胞的一面朝上。
(6)在暗室中，將適量之NTB-2乳膠(或核-4乳膠)移入浸漬用之玻璃器皿中，置40℃水浴中融化，再加入等量40℃蒸餾水，繼續(xù)在水浴中加溫，用玻璃棒輕輕攪拌10min～20min，使氣泡逸出。同時(shí)將準(zhǔn)備做自顯影處理的載玻片，置水浴箱平臺(tái)上預(yù)熱。而后，將附有樣本的載玻片垂直浸漬于乳膠液中約5s。提出玻片，拭去其背面乳膠并待其干固。
(7)將干固的附有樣本的載玻片置于有變色硅膠干燥劑袋的曝光盒中，盒外包黑色避光紙，于4℃冰箱中曝光10d。曝光后，將玻片在D-19顯影液中顯影4min，在停顯液中漂洗30s，在F-5定影液中定影10min，再用水漂洗數(shù)小時(shí)。
(8)細(xì)胞在顯影后用姬姆薩染液染色，脫水透明后，用蓋片封固。在油鏡下，計(jì)數(shù)各樣本細(xì)胞核的顯影銀粒數(shù)，每個(gè)樣本計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，同時(shí)計(jì)數(shù)相當(dāng)面積的本底銀粒數(shù)，兩者之差為細(xì)胞核凈銀粒數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組和對(duì)照組"銀粒數(shù)/核"的均值及其標(biāo)準(zhǔn)差。
2.3.8.6.6 評(píng)價(jià)規(guī)定
用t檢驗(yàn)或其他適當(dāng)?shù)娘@著性檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。當(dāng)各試驗(yàn)劑量組"銀粒數(shù)/核"均值與陰性(溶劑)對(duì)照組者相比，有顯著性意義的增加，并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系時(shí)；或僅一個(gè)劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加，但經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)者，可判為該受試物誘導(dǎo)了DNA修復(fù)合成，具有DNA損傷作用。
2.3.8.7 小鼠精子畸形試驗(yàn)
2.3.8.7.1 目的
以哺乳動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)，檢測(cè)受試物對(duì)雄性生殖細(xì)胞的遺傳毒性(精子形態(tài)異常)。
2.3.8.7.2 試劑
(1)受試物: 常用水、植物油，或用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成混懸液。
(2)陽性對(duì)照物:常用環(huán)磷酰胺或絲裂霉素C。
(3)甲醇（優(yōu)級(jí)純）。
(4)2.5%伊紅溶液:稱取伊紅2.5g，溶于 100 ml蒸餾水中備用。
2.3.8.7.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
成年雄性小鼠至少25只，體重25g～35g。
2.3.8.7.4 試驗(yàn)分組
設(shè)3個(gè)試驗(yàn)劑量組，*高劑量可取*大耐受量，或分別取1/2LD50、1/5LD50、1/20LD50。若采用一次*大限量試驗(yàn)，測(cè)得LD50大于5000mg/kg體重，即以5000mg/kg體重為高劑量。另設(shè)陽性對(duì)照組和陰性(溶劑)對(duì)照組。每組5 只動(dòng)物。
2.3.8.7.5 操作程序
(1)小鼠灌胃染毒。連續(xù) 5d，每天 1 次。
(2)**染毒后 35d，用頸椎脫臼法處死動(dòng)物，剖腹，取出附睪。
(3)將附睪放入盛有2ml生理鹽水的平皿中，用眼科剪剪碎。以3層擦鏡紙過濾，取濾液離心(1000r/min，5min)。
(4)除上清液。加入少量生理鹽水，以混懸液涂片。自然干燥。甲醇固定5min，用伊紅溶液染色1h。
(5)在高倍顯微鏡下，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)精子中的畸形精子數(shù)。精子畸形類型可分為無鉤、香蕉形、胖頭、無定形、尾折疊、雙頭、雙尾等。分別記錄其畸變類型，以統(tǒng)計(jì)精子畸形率及精子畸形類型的構(gòu)成比。
(6)陽性對(duì)照組，腹腔注射環(huán)磷酰胺(每天40mg/kg～60mg/kg體重)，或絲裂霉素C(每天1.0mg/kg～1.5mg/kg體重)。陰性對(duì)照組為受試物溶劑對(duì)照。其他操作程序同試驗(yàn)組。
2.3.8.7.6 評(píng)價(jià)規(guī)定
用χ2檢驗(yàn)或其他適當(dāng)?shù)娘@著性檢驗(yàn)方法對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。當(dāng)各劑量組與陰性(溶劑)對(duì)照組相比，精子畸形率有顯著性意義的增加，并有劑量-反應(yīng)關(guān)系時(shí)；或僅一個(gè)劑量組有顯著性意義的增加，并經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)時(shí)，可判為該受試物對(duì)雄性生殖細(xì)胞具有遺傳毒性。
2.3.8.8 睪丸生殖細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)
2.3.8.8.1 目的
利用細(xì)胞遺傳學(xué)方法，以哺乳動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)檢測(cè)受試物引起的生殖細(xì)胞染色體損傷。試驗(yàn)有小鼠精原細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)和小鼠精母細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)，可根據(jù)情況選做其一，或兩者均做。
2.3.8.8.2 試劑
(1)受試物: 用水、植物油配成溶液，或用 0.5% 羧甲基纖維素鈉制成混懸液。
(2)陽性對(duì)照物: 常用環(huán)磷酰胺，或絲裂霉素。
(3)秋水仙素(0.04%):取40mg秋水仙素，溶于100ml 0.85% 氯化鈉溶液中，過濾**。
(4)甲醇/冰醋酸(3:1，V/V)固定液:臨用現(xiàn)配。
(5)枸掾酸三鈉。
(6)姬姆薩染液:見2.3.8.2.2（9）。
2.3.8.8.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
選用3月～4月齡，體重25g～30g 的雄性小鼠。動(dòng)物總數(shù)不少于25 只。
2.3.8.8.4 試驗(yàn)分組
受試物至少設(shè)3個(gè)試驗(yàn)劑量組，每個(gè)劑量組5只動(dòng)物。另設(shè)陽性對(duì)照組和陰性(溶劑)對(duì)照組。陽性對(duì)照組用環(huán)磷酰胺(40mg/kg體重)或絲裂霉素C(1.5mg/kg～2mg/kg體重)，腹腔注射。
2.3.8.8.5 操作程序
(1)小鼠精原細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)，用經(jīng)口灌胃方式，共染毒兩次，間隔24h。于**次染毒后6h處死動(dòng)物。處死動(dòng)物前3.5h～5.0h腹腔注射0.04%秋水仙素溶液，劑量為4mg/kg體重。
小鼠精母細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)，灌胃染毒，每天1次，連續(xù)5d。于第1次染毒后的第12d～14d將受試動(dòng)物處死。處死動(dòng)物前3.5h～5.0h，腹腔注射0.04%秋水仙素溶液(4mg/kg體重)。
(2)用頸椎脫臼法處死小鼠，取睪丸，去除脂肪。置含2.2%枸櫞酸三鈉溶液平皿中去除睪丸被膜，用針頭使曲精小管松散。一個(gè)動(dòng)物的2個(gè)睪丸可分別或合并處理。
(3)用吸管盡可能去除2.2% 枸櫞酸三鈉溶液，將曲精小管置于含3ml～4ml 低滲液(1%枸 櫞酸三鈉)的試管中。10min后更換低滲液，以去除碎片和精子。在室溫下，低滲時(shí)間總計(jì)不超過25min。低滲結(jié)束后去除低滲液。加入預(yù)冷的固定液(甲醇/冰醋酸)，固定10min后，更換固定液，再固定10min。第3次固定至少30min，也可在冰箱中過夜。用鑷子將已固定的曲精小管移到含50%醋酸5ml的離心管中，吸管吹打至不透光，離心(1000r/min，5min)。
(4)將固定液1.0ml～1.5ml加至離心所得細(xì)胞沉淀物中。滴管吹打后，滴2 滴至用70%乙醇浸濕的玻片，分散后，熱風(fēng)干燥。
(5)用姬姆薩應(yīng)用液在室溫染色10min，自來水淋洗兩次。
(6)以油鏡檢查染色體結(jié)構(gòu)的異常情況。每只動(dòng)物做兩個(gè)睪丸，每個(gè)睪丸分析50個(gè)中期分裂相精原細(xì)胞(或精母細(xì)胞)。記錄觀察染色體型和染色單體型染色體的結(jié)構(gòu)異常。對(duì)精母細(xì)胞染色體還觀察相互易位、X-Y和常染色體的單價(jià)體。
檢查染色體數(shù)目異常時(shí)，記錄非整倍體和多倍體。在小鼠精母細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)時(shí)，只有當(dāng)**次減數(shù)分裂中，四倍體生殖細(xì)胞有一個(gè)被確認(rèn)為四價(jià)體時(shí)才有意義。
2.3.8.8.6 評(píng)價(jià)規(guī)定
用χ2檢驗(yàn)，或其他適當(dāng)?shù)娘@著性檢驗(yàn)方法對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。當(dāng)各劑量組與陰性(溶劑)對(duì)照組相比，畸變細(xì)胞率有顯著性意義的增加，并有劑量-反應(yīng)關(guān)系時(shí)；或僅一個(gè)劑量組有顯著性意義的增加，經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)后，可判為該受試物對(duì)哺乳動(dòng)物睪丸細(xì)胞具有致突變性。
2.3.9 亞慢性毒性試驗(yàn)
2.3.9.1 目的
（1)檢測(cè)**劑較長(zhǎng)期染毒對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒性作用及其靶器官，并確定其*大未觀察到有害作用劑量。
（2)為慢性毒性和致癌試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)提供依據(jù)。
2.3.9.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
一般用嚙齒類動(dòng)物，優(yōu)選大鼠。所用大鼠應(yīng)為 4周～6 周齡者。全部試驗(yàn)至少需用 80 只動(dòng)物。
2.3.9.3 試驗(yàn)分組
將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組(3個(gè)劑量組和1個(gè)對(duì)照組)，每組20只動(dòng)物，雌雄各半。選擇受試物劑量時(shí)，高劑量組應(yīng)出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)，但不引起死亡，如果出現(xiàn)動(dòng)物死亡應(yīng)不超過10%；中間劑量組應(yīng)可觀察到輕微的毒性效應(yīng)；低劑量組應(yīng)不引起任何毒性效應(yīng)(屬未觀察到有害作用劑量)。至于具體的劑量選擇，可考慮高劑量為L(zhǎng)D50的1/20~1/5，高、中、低3個(gè)劑量間的組距以3倍~5倍為宜，*低不小于2倍。另以受試物溶劑代替受試物進(jìn)行試驗(yàn)，作為陰性對(duì)照組。
2.3.9.4 操作程序
（1）采用灌胃方式或?qū)⑹茉囄飺饺腼暳辖?jīng)口染毒。
（2）灌胃法每天灌胃1次，每周稱體重，并按體重調(diào)整受試物給予量。如受試物摻入飼料時(shí)，應(yīng)定期稱飼料消耗量，計(jì)算**劑攝入量。
（3）試驗(yàn)期為3個(gè)月(90d)，末次染毒后24h檢測(cè)各項(xiàng)觀察指標(biāo)，然后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，做病理學(xué)檢查。
2.3.9.5 觀察指標(biāo)
觀察指標(biāo)，可因**劑毒理作用不同而異，一般至少包含以下方面。
（1）臨床觀察：觀察動(dòng)物中毒表現(xiàn)，每周稱量體重1次，食物消耗量至少1次~2次。
（2)血液學(xué)檢查：包括血紅蛋白含量、紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞及其分類計(jì)數(shù)、血小板數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)等。
（3)血液生物化學(xué)檢查：例如天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、尿素氮、肌酐、血清總蛋白和白蛋白、總膽固醇、總膽紅素等。必要時(shí)，可根據(jù)所觀察到的受試物毒性效應(yīng)，或與受試物化學(xué)結(jié)構(gòu)相似物質(zhì)的毒性作用，選擇其他一些生化指標(biāo)。
（4)臟器重量：測(cè)量主要臟器(如肝、腎、腎上腺、睪丸等)的臟器重量和臟器系數(shù)。
（5)病理學(xué)檢查：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死所有動(dòng)物，進(jìn)行系統(tǒng)解剖和肉眼觀察，并將主要器官和組織（如心、肺、肝、腎、脾、腦、腎上腺、睪丸、卵巢、胃腸和系統(tǒng)解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)的異常組織等）固定、保存。當(dāng)各劑量組動(dòng)物尸檢未發(fā)現(xiàn)明顯病變時(shí)，先進(jìn)行高劑量組和陰性對(duì)照組動(dòng)物肝、腎、胃、腸及其它重要的和可能受損的臟器的組織病理學(xué)檢查。如發(fā)現(xiàn)病變，還應(yīng)對(duì)中、低劑量組動(dòng)物相應(yīng)的器官進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。
2.3.9.6 評(píng)價(jià)規(guī)定
將各試驗(yàn)組動(dòng)物觀察指標(biāo)與陰性對(duì)照組加以比較并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，注意各劑量組間的劑量-反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系。評(píng)定受試物*小觀察到有害作用劑量和*大未觀察到有害作用劑量及毒性作用的靶器官。
2.3.10 致畸胎試驗(yàn)
2.3.10.1 目的
檢測(cè)**劑對(duì)妊娠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有無致畸胎性，確定其未觀察到發(fā)育毒性的劑量。
2.3.10.2 試劑
（1)1/1000茜素紅溶液:茜素紅0.1g，氫氧化鉀10g，加蒸餾水1000m1。
（2)透明液A:甘油200ml，氫氧化鉀10g，蒸餾水790ml。
（3)透明液B:甘油與蒸餾水等量混合。
（4)固定液(Bouins液):苦味酸飽和液75份，甲醛20份，冰醋酸5份。
2.3.10.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
試驗(yàn)用大鼠或小鼠(必要時(shí)可用家兔)。用大鼠和小鼠試驗(yàn)時(shí)，取健康、性成熟、未交配過的體重為200g～250g的大鼠，或體重為25g～30g的小鼠。
2.3.10.4 試驗(yàn)分組
至少設(shè)4組，其中3個(gè)為試驗(yàn)組，1個(gè)為陰性對(duì)照組。每組至少有15只孕鼠。高劑量組可用雌鼠的1/10LD50作為試驗(yàn)劑量；低劑量組，可用雌性動(dòng)物的1/100LD50作為試驗(yàn)劑量。其間設(shè)中劑量組。陰性對(duì)照組以受試物的溶劑代替受試物進(jìn)行試驗(yàn)。陽性對(duì)照組常用阿司匹林(300mg/kg體重)、敵枯雙(1mg/kg體重)或維生素A(40000IU)。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室**進(jìn)行的種或品系必需設(shè)陽性對(duì)照組。為了保證試驗(yàn)方法的可靠性，每隔半年需用陽性對(duì)照物檢查一次。
2.3.10.5 操作程序
（1）將雌鼠和雄鼠按 1:1 或 2:1的比例同籠飼養(yǎng)。每日晨觀察陰栓(或**涂片)。查出陰栓或精子的當(dāng)天定為孕期零天。如5d內(nèi)未交配，調(diào)換雌鼠。查出的孕鼠按上述隨機(jī)分組，并進(jìn)行稱重和編號(hào)。
（2）在大、小鼠孕期6d～15d期間，每天用灌胃法給予受試物。分別于孕期0d、6d、10d、15d和20d稱重孕鼠，并根據(jù)體重調(diào)整受試物給予量。注意觀察并記錄孕鼠的毒性反應(yīng)。
（3）大鼠于孕期第20d，小鼠于孕期第18d，用頸椎脫臼法處死。剖腹，取出**稱重，檢查活胎、吸收胎、早期死胎和晚期死胎數(shù)。
（4)逐個(gè)記錄活胎鼠的性別、體重、身長(zhǎng)和尾長(zhǎng)。外觀檢查頭面部、軀干部、四肢等有無畸形，諸如皮下出血、露腦、腦膨出、眼部畸形(無眼或開眼等)、鼻孔擴(kuò)大、單鼻孔、唇裂、脊柱裂、四肢和尾畸形、**閉鎖等。
（5）每窩取約1/2～2/3活胎鼠，用眼科鑷剝皮。取出內(nèi)臟(注意勿拉斷肋骨)，去掉后頸和兩肩胛骨之間的脂肪塊。將胎鼠放入茜素紅溶液染色。當(dāng)天搖動(dòng)玻璃瓶2次～3次。待骨骼染成紅色時(shí)為止。將胎鼠換入透明液A中1d～2d，換入透明液B中2d～3d。待胎鼠骨骼已染紅，而軟組織的紫紅色基本褪去，可換置甘油中。
（6)將染好的標(biāo)本連同甘油一并倒入含水平皿內(nèi)，在解剖顯微鏡下，用透射光源，先觀察胎鼠全身，然后逐步檢查:①頭骨、胸骨、脊椎骨、肋骨和四肢等有無骨化不全、骨化遲緩和其他缺陷。②觀察脊椎骨有無缺失、融合、縱裂等畸形；③觀察胸骨的發(fā)育和數(shù)目，有無胸骨缺失等；④檢查肋骨有無融合肋、分叉肋、肋骨中斷、缺肋、短肋、波狀肋、多肋畸形等；⑤*后檢查四肢骨畸形。
（7)每窩取約 1/3～1/2 活胎鼠浸入固定液2周，作內(nèi)臟檢查。將已固定的胎鼠用水沖凈，仰放于石蠟板上。剪去四肢和尾，用刀片在頭頸部常規(guī)共切4刀，再用剪刀剖開胸、腹腔。著重檢查:①有無裂舌、雙叉舌、裂腭及眼、鼻和腦部的畸形；②是否出現(xiàn)右位心、心臟過大、肺過大或過小等畸形；③消化系統(tǒng)和泌尿生殖系統(tǒng)各器官的大小、形狀以及位置； ④ 有無腎盂積水，雙側(cè)有無睪丸，以及**發(fā)育不全等畸形。
2.3.10.6 評(píng)價(jià)規(guī)定
主要觀察動(dòng)物畸胎出現(xiàn)率，同時(shí)觀察其他指標(biāo)，如著床數(shù)、活胎數(shù)、晚期死胎數(shù)、早期死亡數(shù)，以及活胎體重、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)等。
觀察全部結(jié)果的劑量-反應(yīng)關(guān)系，確定受試物的母體毒性、發(fā)育毒性及致畸性。求出受試物的*小致畸劑量和*大無致畸作用劑量。對(duì)致畸強(qiáng)度應(yīng)以致畸指數(shù)表示。
致畸指數(shù)= (雌鼠LD50)/(*小致畸劑量)
致畸指數(shù)小于或等于10為基本不致畸；大于10至100為致畸；大于100為強(qiáng)致畸。
2.3.11 慢性毒性試驗(yàn)
2.3.11.1 目的
檢測(cè)受試物長(zhǎng)期染毒對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所產(chǎn)生的毒性作用，確定其*小觀察到有害作用劑量，*大未觀察到有害作用劑量及毒性作用的靶器官。
2.3.11.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
試驗(yàn)選用剛離乳的大鼠。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)劑量組每種性別的動(dòng)物應(yīng)不少于10只。中間需活殺動(dòng)物檢查時(shí)，需相應(yīng)增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量。
2.3.11.3 試驗(yàn)分組
將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分在3個(gè)劑量組和1個(gè)陰性對(duì)照組。陰性對(duì)照組除不接觸**劑外，其它與實(shí)驗(yàn)組相同，若在試驗(yàn)中對(duì)受試物使用溶劑或賦形劑時(shí)，陰性對(duì)照組應(yīng)給予相應(yīng)劑量的溶劑或賦形劑。試驗(yàn)劑量根據(jù)亞慢性試驗(yàn)結(jié)果選擇。高劑量應(yīng)引起明顯的毒性效應(yīng)甚至個(gè)別動(dòng)物死亡，低劑量應(yīng)不引起毒性效應(yīng)。
2.3.11.4 操作程序
（1)用灌胃法或?qū)⑹茉囄飺饺腼暳匣蝻嬎形癸暋饺腼暳系氖茉?*劑的*高濃度一般不超過5%。飼料中受試**劑應(yīng)定期監(jiān)測(cè)，觀察其均勻性和穩(wěn)定性。
（2）灌胃法每天給藥一次。
（3）前3個(gè)月每周稱量體重，3個(gè)月后每月稱1次體重，調(diào)整受試物灌胃量。如受試物摻入飼料，應(yīng)定期稱飼料消耗量。如受試物溶于飲水中喂飼，需記錄動(dòng)物的飲水量。
（4)試驗(yàn)期限為一般為6個(gè)月，必要時(shí)可延長(zhǎng)至2 年。
2.3.11.5 觀察指標(biāo)
指標(biāo)與亞慢性毒性試驗(yàn)基本相同，也可根據(jù)受試物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的亞慢性毒性作用和靶器官，可適當(dāng)增加或更換一些針對(duì)性更強(qiáng)更靈敏的觀察指標(biāo)。
（1）臨床觀察：觀察中毒表現(xiàn)，體重前3個(gè)月每周1次，以后每月1次。
（2）血液學(xué)檢查：于試驗(yàn)的第3個(gè)月、6個(gè)月及以后每半年進(jìn)行1次血液學(xué)檢查。
（3）血液生化檢查：檢查時(shí)間同血液學(xué)檢查。
（4）病理學(xué)檢查：
系統(tǒng)解剖：所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括試驗(yàn)過程中死亡的動(dòng)物都應(yīng)進(jìn)行完整的系統(tǒng)解剖和詳盡的肉眼觀察。肉眼可見的異常組織都應(yīng)留樣作進(jìn)一步組織病理學(xué)檢查。
臟器重量：稱取腦、肝、腎、腎上腺和睪丸重量并計(jì)算臟器系數(shù)。
組織學(xué)檢查：對(duì)照組、高劑量組動(dòng)物及系統(tǒng)解剖發(fā)現(xiàn)異常的組織均需作詳盡的組織學(xué)檢查。當(dāng)高劑量組有異常發(fā)現(xiàn)時(shí)，其它劑量組才進(jìn)行相應(yīng)檢查。檢查臟器一般包括腦、心、肺、肝、脾、腎、胃、腸、腎上腺、甲狀腺、垂體、睪丸（卵巢）和**等。
2.3.11.6 評(píng)價(jià)規(guī)定
比較各劑量組與對(duì)照組觀察指標(biāo)的變化。計(jì)算分析其劑量-反應(yīng)關(guān)系，并確定受試物*小觀察到有害劑量和*大未觀察到有害作用劑量，及毒性作用靶器官。
2.3.12 致癌試驗(yàn)
2.3.12.1 目的
檢測(cè)長(zhǎng)期接觸**劑后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)腫瘤的情況，評(píng)價(jià)其致癌性。也可將致癌試驗(yàn)和慢性毒性試驗(yàn)結(jié)合在一批動(dòng)物中進(jìn)行。
2.3.12.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
以剛離乳的大鼠或小鼠進(jìn)行試驗(yàn)。如與慢性毒性試驗(yàn)結(jié)合進(jìn)行，通常選用大鼠。各劑量組和陰性對(duì)照組使用的有效動(dòng)物數(shù)，至少雌雄各50只。如與慢性毒性結(jié)合進(jìn)行，試驗(yàn)中間需處死動(dòng)物進(jìn)行檢查時(shí)，需相應(yīng)增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)。
2.3.12.3 試驗(yàn)分組
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組同慢性試驗(yàn)，一般設(shè)3個(gè)劑量組與1個(gè)陰性對(duì)照組(見2.3.11.3)。根據(jù)亞慢性試驗(yàn)結(jié)果選擇劑量。*高劑量組為*大耐受劑量，可引起輕度毒性效應(yīng)，但不能因腫瘤以外因素明顯縮短其生命期限。*低劑量組應(yīng)不影響動(dòng)物正常的生長(zhǎng)、發(fā)育和壽命，即不引起任何毒性效應(yīng)。中間劑量處于*高和*低劑量之間。若在試驗(yàn)中對(duì)受試物使用溶劑或賦形劑時(shí)，陰性對(duì)照組應(yīng)以相應(yīng)的溶劑或賦形劑進(jìn)行試驗(yàn)。
2.3.12.4 操作程序
（1）將受試物灌胃或摻入飼料或飲水中喂飼。摻入飼料中的受試物*高濃度，不應(yīng)超過 5%。如用灌胃法，每天給藥1次。
（2）前3個(gè)月每周稱體重，3個(gè)月后每月稱體重，并調(diào)整受試物的灌胃量。每周稱飼料消耗量1次。若受試物溶于飲水中喂飼，需記錄飲水量。試驗(yàn)期應(yīng)包括動(dòng)物正常壽命期的大部分時(shí)間，大鼠為2年以上，小鼠為18個(gè)月以上。
（3)試驗(yàn)過程中，除觀察一般臨床癥狀外著重觀察動(dòng)物的腫瘤發(fā)生情況。對(duì)每一肉眼可見或可觸及的腫瘤，其出現(xiàn)的時(shí)間、部位、大小、外形和發(fā)展情況均應(yīng)有記錄。
（4）凡在試驗(yàn)過程中死亡或?yàn)l死而提前處死，以及試驗(yàn)結(jié)束全部處死的動(dòng)物，均應(yīng)進(jìn)行完整的尸檢及系統(tǒng)的、**的、詳細(xì)的器官和組織的病理學(xué)檢查。對(duì)肉眼可見腫瘤或可疑病變組織，對(duì)試驗(yàn)過程中死亡或?yàn)l死而提前處死的動(dòng)物，高劑量組和對(duì)照組的全部動(dòng)物，均需進(jìn)行**的病理組織學(xué)檢查。如果高劑量組腫瘤、癌前病變或增生的發(fā)生率和陰性對(duì)照組者相比，差別有顯著性時(shí)，則中、低劑量組所有動(dòng)物的有關(guān)器官和組織均需進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。若高劑量組存活動(dòng)物數(shù)顯著少于對(duì)照組或存在影響腫瘤發(fā)生的毒作用時(shí)，則中劑量組也應(yīng)按上述高劑量組的要求進(jìn)行系統(tǒng)檢查。
（5）若致癌試驗(yàn)和慢性毒性試驗(yàn)結(jié)合一起進(jìn)行，還應(yīng)按慢性毒性試驗(yàn)的要求，對(duì)有關(guān)指標(biāo)進(jìn)行觀察和記錄。
2.3.12.5 評(píng)價(jià)規(guī)定
（1）腫瘤發(fā)生率：腫瘤發(fā)生率是整個(gè)實(shí)驗(yàn)終了時(shí)，患瘤動(dòng)物總數(shù)在有效動(dòng)物總數(shù)中所占的百分率，有效動(dòng)物總數(shù)是指*早出現(xiàn)腫瘤時(shí)的存活動(dòng)物總數(shù)。
實(shí)驗(yàn)終了時(shí)患瘤動(dòng)物總數(shù)
腫瘤發(fā)生率= ×100%
有效動(dòng)物總數(shù)
（2）致癌試驗(yàn)陽性的判斷標(biāo)準(zhǔn)：按世界衛(wèi)生組織(WHO，1969)提出的下列 4條致癌試驗(yàn)陽性標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
1）陰性對(duì)照組動(dòng)物出現(xiàn)的一種或數(shù)種腫瘤，試驗(yàn)組均有發(fā)生且發(fā)生率超過前者。
2）試驗(yàn)組發(fā)生陰性對(duì)照組未有的腫瘤。
3）試驗(yàn)組腫瘤發(fā)生的時(shí)間早于陰性對(duì)照組者。
4）試驗(yàn)組每個(gè)動(dòng)物的平均腫瘤數(shù)超過陰性對(duì)照組者。
(3)致癌試驗(yàn)陰性結(jié)果的確立
假如動(dòng)物試驗(yàn)規(guī)模為兩種種屬、兩種性別，至少3個(gè)劑量，其中一個(gè)接近*大耐受劑量，每組動(dòng)物至少50只，實(shí)驗(yàn)組腫瘤發(fā)生率與對(duì)照組無差異。
(4）試驗(yàn)報(bào)告：在結(jié)果報(bào)告中，應(yīng)寫明所發(fā)現(xiàn)腫瘤的部位、數(shù)量、性質(zhì)、癌前病變，其它毒性效應(yīng)，以及劑量-反應(yīng)關(guān)系及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果。
2.3.13毒理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果的*終判定
2.3.13.1 **階段試驗(yàn)結(jié)果的判定
（1）在急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)中，LD50＞5000mg/kg體重，可通過；對(duì)于稀釋使用的**劑，當(dāng)LD50≤5000mg/kg體重時(shí)，則需增做**劑*高應(yīng)用濃度5倍的急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)。增做的試驗(yàn)結(jié)果，如果LD50＞5000mg/kg體重，可通過；否則，應(yīng)增做**劑原形樣品的亞慢性毒性試驗(yàn)。
（2）在急性吸入毒性試驗(yàn)中，LC50＞10000mg/m3者，屬于實(shí)際無毒，可通過；否則，應(yīng)放棄使用。
（3）在皮膚刺激試驗(yàn)中，如結(jié)果為無刺激或僅具輕度刺激作用，可通過；否則，應(yīng)放棄使用。
（4）在急性眼刺激試驗(yàn)中，如結(jié)果對(duì)眼無刺激性或具有輕刺激性，可通過；否則，應(yīng)放棄使用。
（5）在**黏膜刺激試驗(yàn)中，如結(jié)果對(duì)**黏膜無刺激性或極輕度刺激性，可通過；否則，應(yīng)放棄使用。
（6）在皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)中，如**劑對(duì)皮膚僅具有極輕度的致敏作用，可通過；否則，應(yīng)放棄使用。
2.3.13.2**階段試驗(yàn)結(jié)果的判定
（1）在亞急性毒性試驗(yàn)中，如各劑量組均未觀察到毒作用，可通過；否則，根據(jù)試驗(yàn)的*小觀察到有害作用劑量或*大未觀察到有害作用劑量（以mg/kg計(jì)），再參考**劑的毒理作用特點(diǎn)和使用條件，由專家評(píng)定。
（2）致突變?cè)囼?yàn)結(jié)果的判定
對(duì)**類**劑所進(jìn)行的分別反映基因水平、體細(xì)胞染色體水平和性細(xì)胞染色體水平的3種類型致突變?cè)囼?yàn)中，如有2種或3種類型試驗(yàn)結(jié)果為陽性，該**劑應(yīng)放棄，不必繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)。如果僅一種類型試驗(yàn)為陽性，應(yīng)再增做另一項(xiàng)同類型致突變?cè)囼?yàn)。若其結(jié)果仍為陽性，該**劑亦應(yīng)放棄使用。
對(duì)**類**劑所進(jìn)行的分別反映基因水平和染色體水平類型的兩項(xiàng)致突變?cè)囼?yàn)中，如均為陽性，該**劑應(yīng)放棄使用，不必繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)。若僅一種類型試驗(yàn)為陽性，應(yīng)再增做另一項(xiàng)同類型致突變?cè)囼?yàn)，如結(jié)果為陰性，可通過；否則需進(jìn)入第三階段或第四階段試驗(yàn)。
對(duì)第三類**劑所進(jìn)行的反映基因水平或體細(xì)胞染色體水平類型一項(xiàng)致突變?cè)囼?yàn)中，如結(jié)果為陰性，可通過；如結(jié)果呈陽性，應(yīng)再增補(bǔ)另一種類型的一項(xiàng)致突變?cè)囼?yàn)，若仍為陽性，該**劑應(yīng)放棄使用。
2.3.13.3 第三階段試驗(yàn)結(jié)果的判定
根據(jù)亞慢性毒性試驗(yàn)和致畸胎試驗(yàn)中的*小觀察到有害作用劑量或*大未觀察到有害作用劑量(以mg/kg體重計(jì))，再參考**劑的毒理作用特點(diǎn)和使用條件，由專家評(píng)定。
2.3.13.4 第四階段試驗(yàn)結(jié)果的判定
根據(jù)慢性試驗(yàn)中的*小觀察到有害作用劑量或*大未觀察到有害作用劑量(以mg/kg計(jì))，或在任何一個(gè)劑量組發(fā)現(xiàn)有致癌作用，均需由有關(guān)專家評(píng)議作出結(jié)論。
2.3.13.5以上各項(xiàng)為**劑**性毒理學(xué)評(píng)定的基本原則。對(duì)特殊情況，應(yīng)由有關(guān)專家評(píng)議作出結(jié)論。
