無機(jī)顯色劑在比色分析中已經(jīng)應(yīng)用不多，主要因?yàn)樯傻慕j(luò)合物不夠穩(wěn)定，靈敏度和選擇性也不高。目前主要應(yīng)用較多的有硫氰酸鹽、鉬酸銨和過氧化氫等。

大多數(shù)有機(jī)顯色劑與金屬離子生成極穩(wěn)定的鰲合物，而且具有特征的顏色，因此選擇性和靈敏度都較高。不少鰲合物宜溶于有機(jī)溶劑，可以進(jìn)行萃取比色，這對(duì)進(jìn)一步提高靈敏度和選擇性很有利。

有機(jī)顯色劑大都是含有生色團(tuán)和助色團(tuán)的化合物。在有機(jī)化合物分子中，一些含有不飽和鍵的基團(tuán)，它們能吸收大于200nm波長(zhǎng)的光這種基團(tuán)稱為廣義的生色團(tuán)。

有機(jī)顯色劑的種類繁多，如OO型鰲合顯色劑、NN型鰲合顯色劑、含S的顯色劑、偶氮類鰲合顯色劑、三苯甲烷類鰲合顯色劑等。顯色劑的分子結(jié)構(gòu)及用途可在分析化學(xué)手冊(cè)上查到。

許多誤差來自吸光度的定量測(cè)定。光度測(cè)定過程包括兩個(gè)階段：**階段是化學(xué)過程，即利用各種化學(xué)反應(yīng)將待測(cè)組分的溶液用適當(dāng)?shù)脑噭┨幚恚勾郎y(cè)組分轉(zhuǎn)變?yōu)橐欢ńM成的化合物，包括有色化合物及各種絡(luò)合物；**階段是物理過程，即將經(jīng)**階段處理的樣品置于儀器中測(cè)定吸光度或繪制吸收光譜。因此，測(cè)定過程中的誤差可以分成化學(xué)的、物理的和人為的三種原因。

1.1 化學(xué)誤差

（1）   平衡效應(yīng)

化學(xué)分析中大多數(shù)是基于被測(cè)定成分與試劑之間的反應(yīng)，從而得到一定的反應(yīng)產(chǎn)物。其測(cè)定方法可分為兩類，一類是測(cè)量所得到的化合物的量；另一類是測(cè)量所消耗的試劑量，從而間接測(cè)定待測(cè)組分的量。它們都廣泛地牽涉到各種化學(xué)平衡，也就是說，在體系中待測(cè)物質(zhì)是與其他化學(xué)成分處于平衡之中。為了確切求得吸收定律中待測(cè)成分的濃度值（c），盡管不是真實(shí)的，但濃度c必須等于或正比于總的或分析的濃度。因此，了解各種平衡的影響是重要的。舉例證明如下。

1）     二聚平衡：重鉻酸鉀在可見光區(qū)450nm處有吸收。假定0.1000mol/L的K₂CrO₄溶液用水稀釋2、3和4倍，顯然，將分別得到0.0500，0.0333和0.0250mol/L溶液。假如將這些溶液于450nm處測(cè)量其吸光度并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果將大大偏離吸收定律。這種偏離被認(rèn)為是來源于下述平衡：

Cr₂O₇^2－（橙色）＋H₂O2HCrO₄^－2H⁺＋2CrO₄^2－（黃色）

對(duì)大多數(shù)波長(zhǎng)來說，重鉻酸根離子的摩爾吸光系數(shù)相差很大，因此，反應(yīng)式中平衡的任何移動(dòng)將影響所測(cè)定的吸光度。當(dāng)0.1000mol/LCr₂O₇^2－離子嚴(yán)格地稀釋2倍時(shí)，Cr₂O₇^2－離子的濃度不是0.0500mol/L，而是明顯地小了，因?yàn)榉磻?yīng)式的平衡由于稀釋而移向右邊。控制反應(yīng)式平衡的*好方法是將它配制在KOH溶液中，使Cr（Ⅵ）實(shí)際上全部轉(zhuǎn)變?yōu)镃rO₄^2－離子。這時(shí)吸收定律將得到遵從，而且溶液是穩(wěn)定可靠的，這種溶液常作為用來校正對(duì)吸收定律可能產(chǎn)生偏差的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

2）     酸—堿平衡：假如一種吸收成分是包括在一個(gè)酸—堿平衡之中，吸收定律將失效，除非將pH值和離子強(qiáng)度保持不變，或者在等吸收點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量。兩個(gè)成分相互平衡，在某一波長(zhǎng)處呈現(xiàn)相同的吸光系數(shù)，該波長(zhǎng)稱為等吸收點(diǎn)。pH效應(yīng)在光度測(cè)定中廣泛存在，因?yàn)樵S多化合物的吸收光譜隨H^＋活度的不同而顯著改變，小到0.1pH的改變都足以引起5%的誤差。

溶液中酸堿度的影響表現(xiàn)在許多方面。

l    由于pH值的不同，形成具有不同的配位數(shù)、不同顏色的絡(luò)合物。這種情況在金屬離子與弱酸陰離子形成較穩(wěn)定的絡(luò)合物時(shí)常遇到。隨著pH值的增大，溶液顏色可能發(fā)生變化，這是由于在酸性溶液中所生成的通常是簡(jiǎn)單的絡(luò)合物，但并沒有達(dá)到陽(yáng)離子的*大配位數(shù)。當(dāng)pH值增大時(shí)，游離的陰離子濃度亦相應(yīng)增大，這就可能生成具有較高配位數(shù)的化合物。例如：鐵離子與水楊酸在不同pH值時(shí)生成的絡(luò)合物為

pH<4       Fe(C₇H₄O₃)⁺  紫色

4< pH<9    Fe(C₇H₄O₃)₂^－ 紅色

9<pH       Fe(C₇H₄O₃)₃^3－ 黃色

應(yīng)用這一類反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定時(shí)，準(zhǔn)確保持溶液的pH值是很重要的。

l    氧化還原反應(yīng)的方向與溶液的酸度有很大關(guān)系。例如，當(dāng)鉻酸鹽量很小時(shí)，則溶液不呈明顯的黃色，但可應(yīng)用二苯卡巴肼，它在酸性溶液中被鉻酸鹽氧化為藍(lán)紫色的化合物而進(jìn)行光度測(cè)定。由于鉻酸鹽的氧化電位與氫離子濃度有很大關(guān)系，因此，在中性或堿性溶液中，由于氧化勢(shì)的降低，即使溶液中的鉻酸鹽的濃度達(dá)0.1mol/L時(shí)也不能將二苯卡巴肼氧化成藍(lán)紫色化合物。   

l    由于pH值的升高而引起金屬離子的水解。當(dāng)有色絡(luò)合物的穩(wěn)定度不很大和被測(cè)定金屬離子的氫氧化物溶解度很小時(shí)，增大溶液的pH值，由于生成金屬的氫氧化物而破壞了有色絡(luò)合物，使溶液的顏色減弱或完全褪色。例如，

Fe(CNS)²⁺＋OH^－Fe(OH)²⁺十CNS^－

l    提高酸度而使有色絡(luò)合物分解。pH值太高會(huì)引起金屬離子水解，pH值太低又會(huì)使有色絡(luò)合物分解，特別是對(duì)于金屬離子與弱酸陰離子形成的絡(luò)合物。這類絡(luò)合物被酸分解的反應(yīng)為

MR十H⁺ M⁺＋HR

 K_平衡 = =K_絡(luò) K_酸

                            [H^＋] = [HR]× ×                         (2-7)

   由2-7式可知，弱酸的酸性愈強(qiáng)(即K_酸愈大)或所生成的絡(luò)合物愈穩(wěn)定(即K_絡(luò)愈小)，所加入的過量試劑濃度愈大，則溶液中可允許的酸度愈大。

總之，pH效應(yīng)是多方面的，因此，控制溶液的pH值是必要的，一般的方法是采用合適的緩沖溶液。

3）     絡(luò)合平衡：光度分析中廣泛應(yīng)用絡(luò)合反應(yīng)，尤其在無機(jī)元素的測(cè)定中更為普遍。因此要求所形成的絡(luò)合物具有高穩(wěn)定性，才能使待測(cè)離子更容易完全轉(zhuǎn)變?yōu)榻j(luò)合物。這不僅在準(zhǔn)確度方面是重要的，而且在測(cè)定靈敏度方面也是重要的，同樣溶液中存在的其他離子對(duì)測(cè)定的影響也就愈小。這說明了絡(luò)合物的穩(wěn)定性對(duì)分光光度分析具有重要意義。絡(luò)合物的穩(wěn)定度是由絡(luò)合物的中心離子與配位體間的化學(xué)親和力來決定的。當(dāng)然，它與各離子的特性，如離子半徑、離子電荷及外層電子結(jié)構(gòu)有密切的關(guān)系。人們雖然不能改變這些待測(cè)離子的內(nèi)部性質(zhì)，但是，從某些重要因素著手，如選擇適宜的試劑，控制反應(yīng)條件(pH、溶劑等)，還是可以使反應(yīng)平衡向有利的方向改變而建立起良好的分析方法。

（2）   溶劑效應(yīng)

   在紫外—可見光分光光度分析中廣泛使用各種溶劑，溶劑效應(yīng)對(duì)于發(fā)色團(tuán)的吸收峰的強(qiáng)度和波長(zhǎng)位置的影響是個(gè)很重要的問題。眾所周知，將碘溶于四氯化碳(介電常數(shù)=2.24)中就得到深紫色溶液，而溶于乙醇(介電常數(shù)=25.8)中就得到紅棕色溶液，它的吸收峰位置及強(qiáng)度都有很大變化。改變?nèi)軇?duì)一個(gè)給定溶質(zhì)的吸收的影響在一般方法中是無法準(zhǔn)確預(yù)料的，但是溶劑的光譜效應(yīng)取決于發(fā)色團(tuán)的電子躍遷類型和溶劑—溶質(zhì)體系的性質(zhì)卻是無疑的。

溶劑效應(yīng)不僅在于溶劑的光譜效應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜而又特殊的問題，而且它的影響涉及到吸收峰的位置、強(qiáng)度、譜帶寬度以及精細(xì)結(jié)構(gòu)等方面，對(duì)定性和定量分析工作都是極端重要的，它也直接關(guān)系到標(biāo)準(zhǔn)譜圖的比較和方法的靈敏度、選擇性以及準(zhǔn)確度。因此，在選擇溶劑時(shí)，首先必須考慮到它的透明度（即在測(cè)定的波長(zhǎng)范圍內(nèi)無吸收），而且對(duì)溶劑可能影響光譜的一些性質(zhì)，如介電常數(shù)、極性、偶極矩、折射指數(shù)、酸堿性等等也必須有所了解。很明顯，為了定性的目的而對(duì)光譜進(jìn)行比較時(shí)，需要使用與標(biāo)準(zhǔn)光譜同一種溶劑，這是很重要的。在一般情況下，→π*躍遷的譜帶如果溶劑由己烷改為乙醇，大約紅移10nm—20nm；相反，丙酮的→π*譜帶由己烷改為乙醇大約藍(lán)移7nm，當(dāng)改用水為溶劑時(shí)，則藍(lán)移8nm。因此，人們將盡可能采用非極性溶劑記錄溶液的吸收光譜。表2-2為某些溶劑的近似截止波長(zhǎng)（假設(shè)光程為1cm），低于此波長(zhǎng)時(shí)它們就不能使用。實(shí)際中這些波長(zhǎng)的*低值很大程度上取決于溶劑的純度。

 

表2-2 一些溶劑的近似截止波長(zhǎng)

（3）      試劑和溶劑中的雜質(zhì)

   分光光度法是很靈敏的方法，溶劑(包括蒸餾水)和試劑中的吸光雜質(zhì)都會(huì)引起不同程度的誤差（甚至試劑級(jí)化學(xué)藥品有時(shí)也是不適用的，即使通過扣除空白值也不能解決問題），其原因是有些雜質(zhì)不僅能吸光，而且還能影響反應(yīng)速度和發(fā)色團(tuán)的產(chǎn)率（增色或減色），甚至參與反應(yīng)。在許多帶羥基的溶劑或試劑中含有雜質(zhì)醛是一個(gè)主要的問題。如在用3-甲基-2-苯并噻唑靈酮腙的分光光度法中，使用受醛污染的2-甲氧基乙醇為溶劑時(shí)空白值比較高。在用苯肼和硫酸測(cè)定17-羥基皮質(zhì)甾(類)時(shí)，使用受醛污染的丁醇為溶劑，將導(dǎo)致一個(gè)負(fù)反應(yīng)。其他影響如在用間苯二酚為試劑的果糖測(cè)定中，當(dāng)使用純的乙醇或乙酸為溶劑時(shí)，λ_*大在480nm；當(dāng)使用的乙酸被痕量的乙醛污染時(shí)，λ_*大改變到550nm。

（4）      試樣中的干擾物質(zhì)

所謂干擾物質(zhì)是指對(duì)于顯色反應(yīng)有影響的物質(zhì)，這些物質(zhì)在一定程度上與試劑發(fā)生反應(yīng)，它在待測(cè)成分所選定的波長(zhǎng)區(qū)間內(nèi)有不可忽視的吸收作用，因而使摩爾吸光系數(shù)或吸光度產(chǎn)生變化。通常有如下幾種類型，①干擾物質(zhì)與待測(cè)成分爭(zhēng)奪試劑。②干擾物質(zhì)與待測(cè)成分起化學(xué)反應(yīng)或產(chǎn)生有色的生成物。③干擾物質(zhì)間接作用。為消除干擾或減少誤差到*小，通常采用：

1）     分離除去干擾物。這種方法因?yàn)榛〞r(shí)間、費(fèi)力氣，有時(shí)還可能增加誤差，故一般不予采用。如能應(yīng)用液-液萃取或色譜法以除去干擾物，還是可行的。

2）     轉(zhuǎn)化干擾物質(zhì)成為非干擾物質(zhì)。這種方法是常用的，因?yàn)樗焖?、?jiǎn)便。例如，以MnO₄^－離子形式測(cè)定Mn時(shí)，F(xiàn)e^3＋離子由于在同一波長(zhǎng)亦有吸收而產(chǎn)生干擾。這種干擾可以用加入H₃PO₄的方法予以消除，因?yàn)镕e^3＋離子與磷酸形成了非吸收的磷酸鹽絡(luò)合物。

1.2 儀器的誤差

   這里所指的誤差主要是讀數(shù)誤差和雜散光引起的誤差。其他的如儀器誤差、波長(zhǎng)精度誤差、非單色光和光程的不一致性等所引起的誤差，這里不再贅述。

（1）      光度讀數(shù)誤差

   在光度分析中，噪音是定量分析準(zhǔn)確度的主要限制，因此，隨機(jī)誤差的主要來源在于吸光的測(cè)量。這種隨機(jī)誤差包括在讀出T或A的刻度中，在用儀器進(jìn)行測(cè)量時(shí)都可能遇到，因此相應(yīng)地引起了濃度（C）的相對(duì)誤差。

   對(duì)多數(shù)分光光度計(jì)，根據(jù)噪音類型可分為兩類情況。一類是帶熱檢測(cè)器，屬于熱噪音或電子噪音；另一類是帶光電發(fā)射檢測(cè)器，屬于散粒效應(yīng)噪音儀器。

（2）      雜散光的影響

雜散光以兩種形式出現(xiàn)，**種是雜散光的波長(zhǎng)與測(cè)量波長(zhǎng)相同，它可能不通過樣品就射到光檢測(cè)器上。這種雜散光是由于各種光學(xué)、機(jī)械零件的反射和散射引起的。**種雜散光是指從單色器出口狹縫發(fā)出的包含少量的與儀器所標(biāo)示的波長(zhǎng)不相符的光，即單色器帶寬以外的光線。它是由光學(xué)系統(tǒng)中的缺陷引起的，如不必要的反射面，傷痕和漏光，象差和不均勻色散以及灰塵的散射等疵病。此外，也可能是由于光柵儀器中其他的衍射級(jí)所引起的。不同儀器的雜散光量都是不相等的。高性能儀器的雜散光大約為千分之幾，通常情況下影響不大。但是在單色器的光譜透射率、光源的光譜強(qiáng)度和檢測(cè)器的靈敏度相當(dāng)?shù)偷臅r(shí)候，即在一臺(tái)儀器的光譜感應(yīng)的極端（如紫外一可見光分光光度計(jì)的200nm—220nm；350nm—400nm及近紅外區(qū)）時(shí)，雜散光可能引起明顯的誤差。

   在給定波長(zhǎng)下雜散光的量，通常以測(cè)量有效強(qiáng)度的百分率表示1%雜散光表示I_s=0.01I_o，I_s為雜散光強(qiáng)度，I_o是在測(cè)定波長(zhǎng)下透過參比液的輻射強(qiáng)度。在雜散光存在下所測(cè)定的透光度T_觀

T_觀= =

=                               （2-8）

式中，為雜散光的分?jǐn)?shù)，即。假設(shè)試樣對(duì)雜散光是透明的，而且I_o>>I_s（大于1%的雜散光是少見的），那么

                                   T_觀=                              （2-9）

總而言之，雜散光在某些情況下可能擾亂吸收帶，而使得測(cè)量結(jié)果偏離吸收定律。當(dāng)雜散光也被樣品吸收時(shí)，則偏離是正的，亦即觀測(cè)到的吸光度大于真正值。如果雜散光不被吸收，則偏離是負(fù)的，觀測(cè)值小于真正吸光度。其Δ A可由式2-10計(jì)算，

                             ΔA=log（1－＋10^A）                        （2-10）

在高吸收時(shí)，由雜散光引起的吸收相對(duì)誤差是相當(dāng)大的。樣品的透射率應(yīng)大于20%，簡(jiǎn)單的稀釋常常是有利的。

1.3 操作條件引起的誤差

這里不列舉一個(gè)操作者能引起的所有操作誤差和方法誤差。討論只限制在測(cè)定過程中的三個(gè)重要方面，即吸收池的維護(hù)和使用；溫度的控制；反應(yīng)或測(cè)量時(shí)間的控制。除此之外，操作者也必須嚴(yán)格遵照操作規(guī)程所列的條件，以保證獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。

（1）      吸收池（比色皿）的維護(hù)和使用，

在一般測(cè)定中是使用兩個(gè)吸收池，一個(gè)作為參比池，另一個(gè)作為樣品池。參比池裝溶劑，樣品池裝試液，這樣安排可以補(bǔ)償由于溶劑的吸收所造成的誤差和減少由于反射和散射所引起的誤差。吸收池必須保持清潔和無傷痕。玻璃和石英吸收池通常可用冷酸或酒精、乙醚等有機(jī)溶劑清洗，避免使用重鉻酸鹽洗滌液，因?yàn)樗鼤?huì)被吸附在吸收池壁上而出現(xiàn)一層鉻化物的薄膜，這種膜很難除去。粘合的玻璃吸收池不能用酸或堿清洗，更要避免用熱濃酸清洗，通常用蒸餾水漂洗，然后用少量溶液潤(rùn)洗，吸收池內(nèi)壁不用干燥，吸收池外璧要用擦鏡紙或軟綢布小心擦干。測(cè)定前后要檢查溶液是否有氣泡、塵埃和不溶性顆粒，這些現(xiàn)象或物質(zhì)的存在都會(huì)引起光散射。使用后必須立即清洗潔凈以作備用。在任何時(shí)候用手拿時(shí)，只能拿吸收池的兩毛玻璃面，不要捏在透光的兩玻璃平面上，以免手上油跡沾污。吸收池內(nèi)壁如果用毛織品或布料去擦，就有擦傷表面的危險(xiǎn)，而且也很難達(dá)到清洗的目的，因此這種做法是不允許的。

（2）      溫度控制

多數(shù)溶液體系的光吸收隨溫度的變化并不顯著，因此，通常溫度對(duì)吸收測(cè)定是個(gè)次要問題，大多數(shù)的分析工作可不必進(jìn)行溫度的精密控制。然而，當(dāng)某些方法需要加熱才能顯色時(shí)，溫度的控制就顯得重要了，假如操作者不留心就會(huì)因顯色不完全而導(dǎo)致誤差；還必須注意到試樣溶液顏色深度是否會(huì)隨溫度而改變的情況。某些化合物，如硫堇的吸收光譜隨溫度的改變有顯著的差異。再如，溫度對(duì)硫代氰酸鐵絡(luò)合物的穩(wěn)定性也有顯著影響。在15℃—25℃范圍內(nèi)，1h內(nèi)絡(luò)合物是穩(wěn)定的，而在30℃時(shí)即使1min也不穩(wěn)定。有些實(shí)驗(yàn)希望獲得高精密度的結(jié)果，例如平衡常數(shù)或動(dòng)力學(xué)方面的測(cè)定，為了消除溫度的影響，須在恒溫的吸收池室中進(jìn)行。在一般情況下，紫外—可見光區(qū)內(nèi)吸收帶是隨溫度的增加而移向較長(zhǎng)波長(zhǎng)，這是因?yàn)槲粘煞值恼駝?dòng)能層將按波茨曼分布定律提高，因此，只需要較少的能量就可以將吸收成分提高到較高電子態(tài)；在紅外區(qū)，吸收帶通常隨溫度的增加而稍微移向較短波長(zhǎng)，這是因?yàn)樵谳^高的振動(dòng)能層各振動(dòng)態(tài)之間的能量稍有增加。假如吸收測(cè)定是在一個(gè)固定波長(zhǎng)和超過一定的溫度范圍進(jìn)行的，不論溫度是上升或下降，所測(cè)得的吸光度將減少，因?yàn)樽V帶已移動(dòng)，這時(shí)的測(cè)定已不在*大吸收處，而是在譜帶的一側(cè)。假如要獲得準(zhǔn)確的摩爾吸光系數(shù)值（譬如在0.5%之內(nèi)），溫度必須控制在±2℃之內(nèi)。有機(jī)化合物的吸收光譜在低溫下呈尖銳峰，而在常溫下曲線較為平滑。

（3）      測(cè)量時(shí)間的控制

反應(yīng)過程往往是較復(fù)雜的，不僅類型各異，而且受各種環(huán)境因素的影響，如反應(yīng)產(chǎn)物顯色時(shí)間的不同，絡(luò)合物隨時(shí)間而分解等等，這些都是常遇到的現(xiàn)象。例如在弱酸介質(zhì)中Al^3＋離子與鋁試劑的反應(yīng)，必須在反應(yīng)15min以后才進(jìn)行測(cè)定。Ag^＋離子與3,3-二甲基聯(lián)胺所生成的藍(lán)色化合物，吸光度開始時(shí)逐漸增加，15min—20min后達(dá)到*大，隨后15min—20min內(nèi)保持恒定，過后就開始下降，因此需在顯色后20min—30min進(jìn)行測(cè)定。V^5＋離子與銅鐵試劑生成的紅褐色化合物，一開始就達(dá)*大，30min后就逐漸消退。上述例子說明，在分析過程中恰當(dāng)掌握*合適的測(cè)定時(shí)間是重要的。

分光光度法的靈敏度和準(zhǔn)確度與實(shí)驗(yàn)技術(shù)和條件有密切關(guān)系。在探索建立一個(gè)新的分光光度分析法或改進(jìn)原有分光光度分析方法時(shí)，亦需反復(fù)實(shí)驗(yàn)選擇*佳實(shí)驗(yàn)技術(shù)和條件。在實(shí)驗(yàn)選擇分析條件時(shí)，由于影響因素較多，可采用多因素優(yōu)選法，如正交法或單純形法。

2.1 pH值的選擇

在分光光度法的定量分析中，為了選擇確定*適宜酸度，考慮到酸度值往往是*主要的影響因素，可用單因素實(shí)驗(yàn)法。常用的方法是：將具有不同pH值但含有同一量的被測(cè)物質(zhì)的一系列溶液，于分光光度計(jì)上測(cè)量其相應(yīng)吸光度值，然后以吸光度對(duì)溶液的pH或酸度作圖，得一酸度曲線。該曲線中吸光度值*大且保持不變的區(qū)間所對(duì)應(yīng)的pH值范圍，即為待測(cè)物質(zhì)分光光度測(cè)定的*適宜酸度范圍。

2.2 溶劑的選擇

如果待測(cè)物質(zhì)是顯色測(cè)定，應(yīng)盡量采用水作為溶劑以求簡(jiǎn)便，并防止分析人員長(zhǎng)期使用某些有機(jī)溶劑而中毒。如果水相介質(zhì)測(cè)定達(dá)不到分析目的時(shí)（例如靈敏度差、干擾無法消除等），則考慮使用有機(jī)溶劑或用萃取—分光光度法。

2.3 溫度的選擇

溫度變化不大時(shí)，對(duì)分光光度法的影響甚微，故在定量分析中通常不必恒溫。但若我們利用顯色反應(yīng)將待測(cè)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為有色化合物進(jìn)行測(cè)定，則溫度對(duì)于顯色反應(yīng)速度可能有較大影響，故需控制適宜溫度使反應(yīng)進(jìn)行完全，而且也必須考慮在該溫度下待測(cè)物質(zhì)、顯色劑及有色絡(luò)合物的穩(wěn)定性。一般說來，顯色反應(yīng)多在室溫下完成。對(duì)于速度較慢的顯色反應(yīng)宜選擇較高溫度以縮短顯色時(shí)間。對(duì)于不同的顯色反應(yīng)應(yīng)選擇各自的適宜顯色溫度。

2.4 測(cè)定時(shí)間的選擇

有色化合物穩(wěn)定的時(shí)間范圍按下法確定：在加入顯色劑后，連續(xù)測(cè)量和記錄該溶液的吸光度值。并以吸光度值對(duì)時(shí)間作圖繪出“時(shí)間曲線”。該曲線的平臺(tái)區(qū)（即吸光度恒定不變的區(qū)間）所對(duì)應(yīng)的時(shí)間區(qū)間即為該有色化合物穩(wěn)定的時(shí)間范圍。吸光度的測(cè)定應(yīng)在此時(shí)間范圍內(nèi)盡快完成。

2.5 入射光波長(zhǎng)的選擇

根據(jù)朗伯—比耳定律可知，在一定波長(zhǎng)下，如果液槽厚度保持不變，則溶液的吸光度與溶液的濃度成正比。根據(jù)式2-11：

                          log                          （2-11）

式中 ——吸光度；

——透光度；

      ——摩爾吸光系數(shù)，

      ——液層厚度；

——物質(zhì)的量濃度。

上式表明，溶液的透光度并不與濃度成正比，只是log與成正比。說明在一定波長(zhǎng)及液槽厚度保持不變的條件下，濃度與吸光度或透光度之間的關(guān)系。吸光度與濃度之間為一線性關(guān)系，而透光度卻不是這種關(guān)系。因此在定量分析的實(shí)際工作中，采用吸光度，這樣就避免了將換算成log的麻煩。

在實(shí)際應(yīng)用中，通常借助吸收曲線來選擇測(cè)定的適宜波長(zhǎng)。所謂吸收曲線，就是使不同波長(zhǎng)的光透過某一固定濃度的溶液，測(cè)量其吸光度。然后，以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖。所得曲線稱為吸收曲線。吸光度值*大時(shí)的波長(zhǎng)以λ_*大表示，此波長(zhǎng)即為測(cè)定時(shí)所選用的入射光波長(zhǎng)，此時(shí)的摩爾吸光系數(shù)*大，測(cè)定靈敏度*高。但有時(shí)為避免干擾，不選擇*大吸收波長(zhǎng)，而選擇其次的吸收峰為工作波長(zhǎng)，這樣雖然靈敏度不是*高，但能避免干擾，提高了方法的選擇性。

2.6 相對(duì)誤差與吸光度的關(guān)系

分光光度計(jì)都有一定的測(cè)量誤差，實(shí)踐證明，吸光度在0.2～0.5內(nèi)測(cè)量的相對(duì)誤差*小。

為使被測(cè)溶液的吸光度在0.2～0.5之內(nèi)，可以用下面兩種方法來調(diào)整。**是控制被測(cè)溶液的濃度，如改變?nèi)恿?，改變?nèi)芤旱臐饪s倍數(shù)或稀釋倍數(shù)。**是選擇不同的比色皿，比色皿的光程長(zhǎng)度為0.5～5.0cm（甚至10cm），吸光度小的要用長(zhǎng)的比色皿，吸光度大的溶液要用光程短的比色皿。例如某溶液用1cm比色皿測(cè)定時(shí)吸光度為0.05，改用5cm比色皿測(cè)定時(shí)，吸光度就變?yōu)?.25了，反過來對(duì)吸光度大的樣品也可以同樣調(diào)整。

2.7 參比溶液的選擇

參比溶液又稱為空白溶液或比較溶液。其作用在于調(diào)節(jié)分光光度計(jì)的吸光度為0（透過率100%），即標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)溶液的吸光度相對(duì)于參比溶液而測(cè)得。

測(cè)量時(shí)選用何種參比溶液需視具體情況而定。

（1）   如被測(cè)液中，僅顯色劑與待測(cè)組分生成有色化合物，而顯色劑與其他試劑無色，溶液中亦無其他有色離子時(shí)，可用蒸餾水或去離子水作為參比溶液。

（2）   除顯色劑與待測(cè)組分所生成的化合物有色外，溶液中亦存在其他有色離子，而且顯色劑無色，此時(shí)可用不加顯色劑的被測(cè)液作為參比溶液。

（3）   當(dāng)顯色劑本身具有顏色時(shí)，則用顯色劑溶液作為參比溶液。如果顯色劑和被測(cè)溶液都有色時(shí)，可將一份試液加入適當(dāng)掩蔽劑，把被測(cè)組分掩蔽起來，使之不再與顯色劑反應(yīng)，再加入與被測(cè)溶液相等的顯色劑和其他試劑，這樣的參比溶液能消除共存組分的干擾。

上述原則僅適用于可見分光光度法。紫外分光光度法中可按類似原則選擇，但多用有機(jī)溶劑作為參比溶液。