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生物樣品的預(yù)處理

日期:2025-02-06 06:52
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摘要:
 生物樣品的預(yù)處理
由于生物樣品中含有大量有機(jī)物(母質(zhì)),且所含有害物質(zhì)一般都在痕量和超痕量級(jí)范圍,因此測定前必須對(duì)樣品進(jìn)行分解,對(duì)欲測組分進(jìn)行富集和分離,或?qū)Ω蓴_組分進(jìn)行掩蔽等。這些工作屬于預(yù)處理。
一、消解和灰化
測定生物樣品中的微量金屬和非金屬元素時(shí),通常都要將其大量有機(jī)物基體分解,使欲測組分轉(zhuǎn)變成簡單的無機(jī)化合物或單質(zhì)(如汞),然后進(jìn)行測定。分解有機(jī)物的方法有濕法消解和干法灰化。這兩種方法的基本內(nèi)容在**章已介紹,此處僅結(jié)合生物樣品的分解略述之。
(一)濕法消解
濕法消解生物樣品常用的消解試劑體系有:硝酸-高氯酸、硝酸-硫酸、硫酸-過氧化氫、硫酸-高錳酸鉀、硝酸-硫酸-五氧化二釩等。
對(duì)于含大量有機(jī)物的生物樣品,特別是脂肪和纖維素含量高的樣品,如肉、脂肪、面粉、稻米、秸桿等,加熱消解時(shí)易產(chǎn)生大量泡沫,容易造成被測組分的損失。若先加硝酸,在常溫下放置24h后再消解,可大大減少泡沫的產(chǎn)生。在某些情況下,可以加入防起泡劑(見表6-8)。
表6-8 蒸發(fā)及濕法消解樣品用的防起泡劑
 
采用硝酸-硫酸消解法,能分解各種有機(jī)物,但對(duì)吡啶及其衍生物(如煙堿)、毒殺芬等分解不完全。樣品中的鹵素在消解過程中可完全損失,汞、砷、硒等有一定程度的損失。
硝酸-高氯酸消解生物樣品是破壞有機(jī)物比較有效的方法,但要嚴(yán)格按照操作程序,防止發(fā)生爆炸。
硝酸-過氧化氫消解法應(yīng)用也比較普遍,有人用該方法消解生物樣品測定氮、磷、鉀、硼、砷、氟等元素。
高錳酸鉀是一種強(qiáng)氧化劑,在中性、堿性和酸性條件下都可以分解有機(jī)物。測定生物樣品中汞時(shí),用1∶1硫酸和硝酸混合液加高錳酸鉀,于6O℃保溫分解魚、肉樣品;用5%高錳酸鉀的硝酸溶液于85℃回流消解食品和尿液;用硫酸加過量高錳酸鉀分解尿樣等,都可獲得滿意的效果。
測定動(dòng)物組織、飼料中的汞,使用加五氧化二釩的硝酸和硫酸混合液催化氧化,溫度可達(dá)190℃,能破壞甲基汞,使汞全部轉(zhuǎn)化為無機(jī)汞。
生物樣品中氮的測定,沿用凱氏消解法,即在樣品中加濃硫酸消解,使有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為銨鹽。為提高消解溫度,加速消解過程,可在消解液中加入硫酸銅、硒粉或硫酸汞等催化劑。加硫酸鉀對(duì)提高消解溫度也可起到較好的效果。以—NH2及=NH形態(tài)存在的有機(jī)氮化合物,用硫酸、硝酸加催化劑消解的效果是好的,但雜環(huán)、N—N鍵及硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮不能定量轉(zhuǎn)化為銨鹽,可加入還原劑如葡萄糖、苯甲酸、水楊酸、硫代硫酸鈉等,使消解過程中發(fā)生一系列復(fù)雜氧化還原反應(yīng),則能將硝態(tài)氮還原為氨。
用過硫酸鹽(強(qiáng)氧化劑)和銀鹽(催化劑)分解尿液等樣品中的有機(jī)物可獲得較好的效果。
近年來,應(yīng)用增壓溶樣法分解有機(jī)物樣品和難分解的無機(jī)物樣品有所發(fā)展。該方法將生物樣品放入外包不銹鋼殼的聚四氟乙烯坩堝內(nèi),加入混合酸或氫氟酸,在140—160℃保溫2—6h,即可將有機(jī)物分解,獲得清亮的樣品溶液。隨著聚四氟乙烯加工技術(shù)的提高,外面不用鋼殼保護(hù),已開始推廣應(yīng)用。
(二)灰化法
灰化法分解生物樣品不使用或少使用化學(xué)試劑,并可處理較大稱量的樣品,故有利于提高測定微量元素的準(zhǔn)確度。但是,因?yàn)榛一瘻囟纫话銥?50—550℃,不宜處理測定易揮發(fā)組分的樣品。此外,灰化所用時(shí)間也較長。
根據(jù)樣品種類和待測組分的性質(zhì)不同,選用不同材料的坩堝和灰化溫度。常用的有石英、鉑、銀、鎳、鐵、瓷、聚四氟乙烯等材質(zhì)的坩堝。部分生物和食品樣品的灰化溫度列于表6-9。
表6-9 部分生物和食品樣品的灰化溫度
 
通?;一飿悠凡患悠渌噭珵榇龠M(jìn)分解,抑制某些元素?fù)]發(fā)損失,常加適量輔助灰化劑,如加入硝酸和硝酸鹽,可加速樣品的氧化,疏松灰分,利于空氣流通;加入硫酸和硫酸鹽,可減少氯化物的揮發(fā)損失;加入堿金屬或堿土金屬的氧化物、氫氧化物或碳酸鹽、醋酸鹽,可防止氟、氯、砷等的揮發(fā)損失;加入鎂鹽,可防止某些待測組分和坩堝材料發(fā)生化學(xué)反應(yīng),抑制磷酸鹽形成玻璃狀熔融物包裹未灰化的樣品顆粒等。但是,用碳酸鹽作輔助灰化劑時(shí),會(huì)造成汞和鉈的全部損失,硒、砷和碘有相當(dāng)程度的損失,氟化物、氯化物、溴化物有少量損失。表6-10列舉出測定某些生物樣品中氟,用干灰法分解樣品加入的輔助灰化劑和控制條件。
表6-10 干灰法處理測氟生物樣品的輔助灰化劑
 
樣品灰化完全后,經(jīng)稀硝酸或鹽酸溶解供分析測定。如酸溶液不能將其完全溶解時(shí),則需要將殘?jiān)酉←}酸煮沸,過濾,然后再將殘?jiān)脡A融法灰化。也可以將殘?jiān)脷浞崽幚?,蒸干后用稀酸溶解供測定。
隨著低溫灰化技術(shù)的發(fā)展,使測定生物樣品中易揮發(fā)元素,如砷、汞、硒、氟等取得很好的效果。高頻電場激發(fā)氧灰化技術(shù)是用高頻電場激發(fā)氧氣產(chǎn)生激發(fā)態(tài)氧原子處理樣品,一般在150℃以下就可使樣品完全灰化。氧瓶燃燒法也是一種簡易低溫灰化方法。該方法將樣品包在無灰濾紙中,濾紙包鉤掛在繞結(jié)于磨口瓶塞的鉑絲上,瓶內(nèi)放入適當(dāng)吸收液(如測氟用0.1mol/LNaOH溶液;測汞用硫酸-高錳酸鉀溶液等),并預(yù)先充入氧氣。將濾紙點(diǎn)燃后,迅速插入瓶內(nèi),蓋嚴(yán)瓶塞,使樣品燃燒灰化。待燃燒盡,搖動(dòng)瓶內(nèi)溶液,使燃燒產(chǎn)物溶解于吸收液,吸收液供測定。
氧彈法可用于灰化測定汞、硫、砷、氟、硒、硼、氚和14碳等組分的生物樣品。將樣品研成粉末并壓成片,放入樣品杯,裝在有鉑內(nèi)襯的氧彈內(nèi)(50—300mL,內(nèi)有吸收液),旋緊蓋,充入純氧氣,用電火花引發(fā)樣品燃燒,燃燒產(chǎn)物被吸收液吸收后供測定。表6-11列舉了部分生物樣品灰化實(shí)例。
表6-11 氧彈法灰化生物樣品實(shí)例
 
二、提取和濃縮
測定生物樣品中的農(nóng)藥、石油烴、酚等有機(jī)污染物時(shí),需要用溶劑將欲測組分從樣品中提取出來,提取效率的高低直接影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確度。如果存在雜質(zhì)干擾和待測組分濃度低于分析方法的*低檢測濃度問題,還要進(jìn)行凈化和濃縮。
隨著近代分析技術(shù)的發(fā)展,對(duì)環(huán)境樣品中的污染物已從單獨(dú)分析發(fā)展到多種污染物連續(xù)分析。因此,在進(jìn)行污染物的提取、凈化和濃縮時(shí),應(yīng)考慮到多種污染物連續(xù)分析的需要。
(一)提取方法
提取生物樣品中有機(jī)污染物的方法應(yīng)根據(jù)樣品的特點(diǎn),待測組分的性質(zhì)、存在形態(tài)和數(shù)量,以及分析方法等因素選擇。常用的提取方法有:振蕩浸取法、組織搗碎提取法和脂肪提取器提取法。
1.振蕩浸取法
蔬菜、水果、糧食等樣品都可使用這種方法。將切碎的生物樣品置于容器中,加入適當(dāng)?shù)娜軇旁谡袷幤魃险袷幗∫欢〞r(shí)間,濾出溶劑后,用新溶劑洗滌樣品濾殘或再浸取一次,合并浸取液,供分析或進(jìn)行分離、富集用。
2.組織搗碎提取
取定量切碎的生物樣品,放入組織搗碎杯中,加入適當(dāng)?shù)奶崛?,快速搗碎3—5min,過濾,濾渣重復(fù)提取一次,合并濾液備用。該方法提取效果較好,應(yīng)用較多,特別是從動(dòng)植物組織中提取有機(jī)污染物質(zhì)比較方便。
3.脂肪提取器提取
索格斯列特(Soxhlet)式脂肪提取器,簡稱索氏提取器或脂肪提取器,常用于提取生物、土壤樣品中的農(nóng)藥、石油類、苯并(a)芘等有機(jī)污染物質(zhì)。其提取方法是:將制備好的生物樣品放入濾紙筒中或用濾紙包緊,置于提取筒內(nèi);在蒸餾燒瓶中加入適當(dāng)?shù)娜軇B接好回流裝置,并在水浴上加熱,則溶劑蒸氣經(jīng)側(cè)管進(jìn)入冷凝器,凝集的溶劑滴入提取筒,對(duì)樣品進(jìn)行浸泡提取。當(dāng)提取筒內(nèi)溶劑液面超過虹吸管的頂部時(shí),就自動(dòng)流回蒸餾瓶內(nèi),如此重復(fù)進(jìn)行。因?yàn)闃悠房偸桥c純?nèi)軇┙佑|,所以提取效率高,且溶劑用量小,提取液中被提取物的濃度大,有利于下一步分析測定。但該方法費(fèi)時(shí),常用作研究其他提取方法的對(duì)照比較方法。
4.直接球磨提取法
該方法用己烷作提取劑,直接將樣品在球磨機(jī)中粉碎和提取,可用于提取小麥、大麥、燕麥等糧食中的有機(jī)氯及有機(jī)磷農(nóng)藥。由于不用極性溶劑提取,可以避免以后費(fèi)時(shí)的洗滌和液-液萃取操作,是一種快速提取方法。提取用的儀器是一個(gè)50mL的不銹鋼管,鋼管內(nèi)放兩個(gè)小鋼球,放入1—5g樣品,加 2—8g無水硫酸鈉,20mL己烷,將鋼管蓋緊,放在350r/min的搖轉(zhuǎn)機(jī)上,粉碎提取30min即可,回收率和重現(xiàn)性都比較好。
選擇提取劑應(yīng)考慮樣品中欲測有機(jī)污染物的性質(zhì)和存在形式,因?yàn)樯飿悠分杏袡C(jī)污染物一般含量都很低,故要求用高純度的溶劑。例如,測定農(nóng)藥殘留量,一般要求所用溶劑中雜質(zhì)含量在10g以下。普通溶劑應(yīng)進(jìn)行純化處理。
此外,提取劑還應(yīng)根據(jù)“相似相溶”原理選擇。如對(duì)于極性小的有機(jī)氯農(nóng)藥、多氯聯(lián)苯等,用極性小的己烷、石油醚等提??;而對(duì)于極性較強(qiáng)的有機(jī)磷農(nóng)藥和強(qiáng)極性的含氧除草劑等,原則上要選用強(qiáng)極性溶劑提取,如二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮等。
一般認(rèn)為提取劑的沸點(diǎn)在45—80℃之間為宜。沸點(diǎn)太低,容易揮發(fā);沸點(diǎn)太高,不易濃縮富集,而且在濃縮時(shí)會(huì)使易揮發(fā)或熱穩(wěn)定性差的污染物損失。
其他,如溶劑的毒性、價(jià)格以及對(duì)檢測器是否有干擾等也是應(yīng)考慮的因素。
為提高提取效果,可選用單一溶劑,也可用混合溶劑。常用的提取劑有:正己烷、石油醚、乙腈、丙酮、苯、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基甲酰胺等。常用的混合溶劑體系有:正己烷(或石油醚)- 丙酮、乙腈-水、正己烷(或石油醚)-乙醚、正己烷(或石油醚)-異丙醇、正己烷(或石油醚)-二氯甲烷、甲醇-三氯甲烷、正己烷(或石油醚)-乙腈、正己烷(或石油醚)-甲醇、三氯甲烷-乙酸乙酯等。
對(duì)于含多種復(fù)雜組分樣品的系統(tǒng)分析,還可用多種溶劑分別進(jìn)行多次提取。
(二)分離
用提取劑從生物樣品中提取欲測組分的同時(shí),不可避免地會(huì)將其他相關(guān)組分提取出來。例如,用石油醚等提取有機(jī)氯農(nóng)藥時(shí),也將脂肪、臘質(zhì)、色素等一起提取出來。因此,在測定之前,還必須將上述雜質(zhì)分離出去。常用的分離方法有:液-液萃取法、層析法、磺化法、低溫冷凍法、吹蒸法、液上空間法等。
1.液-液萃取法
液-液萃取法是依據(jù)有機(jī)物組分在不同溶劑中分配系數(shù)的差異來實(shí)現(xiàn)分離的(見**章)。例如,農(nóng)藥與脂肪、蠟質(zhì)、色素等一起被提取后,加入一種極性溶劑(如乙腈)振搖,由于農(nóng)藥的極性比脂肪、蠟質(zhì)、色素要大一些,故可被乙腈萃取。經(jīng)幾次萃取,農(nóng)藥幾乎完全可以與脂肪等雜質(zhì)分離,達(dá)到凈化的目的。農(nóng)藥殘留量分析中的液-液萃取多屬用極性溶劑從非極性溶劑中提取,為表示這種萃取方法的效果,引入了p值的概念。所謂p值是指在體積相等的兩種互不相溶的溶劑中分配達(dá)平衡時(shí)某種農(nóng)藥存在于非極性溶劑中的份數(shù)。相應(yīng)的該農(nóng)藥存在于極性溶劑中的份數(shù)用q值表示。顯然,p+q=1。根據(jù)分配系數(shù)的概念,該情況下分配系數(shù)K可表示為如下形式:
 
若p值等于0.70,表明等體積分配達(dá)到平衡時(shí),有70%的農(nóng)藥存在于非極性溶劑中,其余30%存在于極性溶劑中。可見,p值越小,存在于極性溶劑中的農(nóng)藥越多,越有利于用極性溶劑從非極性溶劑中萃取農(nóng)藥。表6-12列出幾種常用農(nóng)藥在兩種溶劑體系中的p值。用極性溶劑等體積多次萃取非極性溶劑中的農(nóng)藥,其萃取份數(shù)可用下式計(jì)算:
E=Pn
E=1-Pn
式中:E——非極性溶劑中農(nóng)藥的份數(shù);
E——極性溶劑中農(nóng)藥的份數(shù);
n——萃取次數(shù)。
如果用非極性溶劑多次等體積提取極性溶劑中的農(nóng)藥,其萃取份數(shù)計(jì)算式如下:
E=(1-p)n
E=1-(1-p)n
在實(shí)際工作中,有時(shí)用極性溶劑多次不等體積萃取非極性溶劑中的農(nóng)藥,此時(shí)按下式計(jì)算萃取率:
 
。
2.層析法
層析法分為柱層析法、薄層層析法、紙層析法等。其中,柱層析法在處理生物樣品中用的較多。這種方法的原理是將生物樣品的提取液通過裝有吸附劑的層析柱,則提取物被吸附在吸附劑上,但由于不同物質(zhì)與吸附劑之間的吸附力大小不同,當(dāng)用適當(dāng)?shù)娜軇┝芟磿r(shí),則按照一定的順序被淋洗出來,吸附力小的組分先流出,吸附力大的組分后流出,使它們彼此得以分離。
吸附劑分為無機(jī)吸附劑和有機(jī)吸附劑。常用的無機(jī)吸附劑有硅酸鎂、氧化鋁、活性炭、硅藻土等;有機(jī)吸附劑有纖維素、高分子微球、網(wǎng)狀樹脂等。
用經(jīng)活化的硅酸鎂制備的層析柱是分離農(nóng)藥常用的凈化柱。表6-13列出以乙醚-石油醚混合液為淋洗溶劑的硅酸鎂層析柱分離各種農(nóng)藥的情況。說明淋洗液的極性依次增大,淋洗下來的農(nóng)藥極性也依次增大。
3.磺化法和皂化法
磺化法是利用提取液中的脂肪、臘質(zhì)等干擾物質(zhì)能與濃硫酸發(fā)生磺化反應(yīng),生成極性很強(qiáng)的磺酸基化合物,隨硫酸層分離,而達(dá)到與提取液中農(nóng)藥分離的目的。然后,經(jīng)洗去殘留的硫酸、脫
表6-12 幾種常用農(nóng)藥的p值(25.5℃±0.5)
 
表6-13 硅酸鎂-乙醚-石油醚層析體系分離農(nóng)藥
 
水,得到純化的提取液。該方法常用于有機(jī)氯農(nóng)藥的凈化,對(duì)于易被酸分解或與之起反應(yīng)的有機(jī)磷、氨基甲酸酯類農(nóng)藥,則不適用。
皂化法是利用油脂等能與強(qiáng)堿發(fā)生皂化反應(yīng),生成脂肪酸鹽而將其分離的方法。例如,用石油醚提取糧食中的石油烴,同時(shí)也將油脂提取出來,如在提取液中加入氫氧化鉀-乙醇溶液,油脂與之反應(yīng)生成脂肪酸鉀鹽進(jìn)入水相,而石油烴仍留在石油醚中。
4.低溫冷凍法
該方法基于不同物質(zhì)在同一溶劑中的溶解度隨溫度不同而不同的原理進(jìn)行彼此分離的。例如,將用丙酮提取生物樣品中農(nóng)藥的提取液置于-70℃的冰-丙酮冷阱中,則由于脂肪和臘質(zhì)的溶解度大大降低而沉淀析出,農(nóng)藥仍留在丙酮中。經(jīng)過濾除去沉淀,獲得經(jīng)凈化的提取液。這種方法的*大優(yōu)點(diǎn)是有機(jī)化合物在凈化過程中不發(fā)生變化,并且有良好的分離效果。
5.吹蒸法和液上空間法
吹蒸法又稱氣提法,即用氣體將溶解在溶液中的揮發(fā)性物質(zhì)分離出來,適用于一些易揮發(fā)農(nóng)藥和揮發(fā)油的分離。該方法的操作過程是用乙酸乙酯提取生物樣品中的農(nóng)藥,取相當(dāng)于2g樣品的提取液1mL,分四次注入Storherr管,該管內(nèi)填充玻璃棉、砂子等,一般加熱到180—250℃,并以600mL/min流速吹入氮?dú)?。每次進(jìn)樣后吹3min,*后再用250μL乙酸乙酯吹洗一次。經(jīng)這樣處理后,提取液中的脂肪、臘質(zhì)、色素等高沸點(diǎn)雜質(zhì)仍留在Storherr管中,農(nóng)藥則被氮?dú)饬鲾y帶,經(jīng)聚四氟乙烯冷螺旋管收集于玻璃管中,達(dá)到分離的目的。方法快速、簡便,凈化一個(gè)樣品約需20min。
液上空間法是根據(jù)氣液平衡分配的原理與氣相色譜相結(jié)合,用于生物樣品中揮發(fā)性組分的分離和測定技術(shù)。將樣品提取液移入密閉容器中,稍提高容器的溫度,經(jīng)平衡一定時(shí)間后,抽取提取液上空的氣體注入色譜儀分析。如果改用吹氣和疏水性吸附劑富集,再經(jīng)洗脫后進(jìn)行色譜分析,則檢測限還可降低,但必須選擇合適的吸附劑、吸附和解吸條件及氣提速度。
(三)濃縮
生物樣品的提取液經(jīng)過分離凈化后,其中的污染物濃度往往仍達(dá)不到分析方法的要求,這就需要進(jìn)行濃縮。常用的濃縮方法有:蒸餾或減壓蒸餾法、K-D濃縮器濃縮法、蒸發(fā)法等。其中,K-D濃縮器法是濃縮有機(jī)污染物的常用方法。
K-D濃縮器是一種高效濃縮儀器。早期的儀器在常壓下濃縮,近些年加上了毛細(xì)管,可進(jìn)行減壓濃縮,提高了濃縮速度。生物樣品中的農(nóng)藥、苯并(a)芘等極毒、致癌性有機(jī)污染物含量都很低,其提取液經(jīng)凈化分離后,都可以用這種方法濃縮。為防止待測物損失或分解,加熱K-D濃縮器的水浴溫度一般控制在50℃以下,*高不超過80℃。特別要注意不能把提取液蒸干。若需進(jìn)一步濃縮,需用微溫蒸發(fā)。如用改進(jìn)后的微型Snyder柱再濃縮,可將提取液濃縮至 0.1—0.2mL。

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