5.1蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定

 

蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，它的含量是衡量農(nóng)、畜、水產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)，在育種、食品和飼料等工作中常常需要測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，也是蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物。全氨基酸和個(gè)別氨基酸的分析測(cè)定是研究蛋白質(zhì)、酶的化學(xué)組成及性質(zhì)的重要手段。生物學(xué)及農(nóng)業(yè)科學(xué)的許多領(lǐng)域都需要分析氨基酸。在評(píng)價(jià)谷物的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值時(shí)需要測(cè)定游離氨基酸及蛋白質(zhì)的氨基酸組成，動(dòng)植物產(chǎn)品中的氨基酸以多種形式存在，大致可分為兩種，即構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸和游離的氨基酸，另外，還有少量的由肽鍵連接的幾個(gè)氨基酸，以及與糖或脂結(jié)合在一起的，在入類(lèi)和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)上，各種氨基酸含量的高低是很重要的，特別是有幾個(gè)限制性氨基酸，如稱(chēng)為“**、**限制氨基酸”的賴(lài)氨酸和色氨酸，是必需氨基酸，即必須從食物中直接吸收，而不能由入與動(dòng)物利用食物中的其它成分自身合成，卻又對(duì)入和動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育起著重要作用的氨基酸；若缺乏這些氨基酸，入和動(dòng)物不僅不能正常發(fā)育，還會(huì)引起某些**，而這些氨基酸在貯存和加工的過(guò)程中極易損失破壞，因此它們的實(shí)際含量已成為衡量谷物、飼料蛋白質(zhì)的重要標(biāo)準(zhǔn)之一

 

5.1.1蛋白質(zhì)的測(cè)定

 

蛋白質(zhì)的分析方法很多，可分為兩類(lèi)，即間接法和直接法。間接法是利用蛋白質(zhì)中含有一定量的氮，通過(guò)測(cè)定樣品中的含氮量再乘以換算系數(shù)，計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量，如開(kāi)氏法；直接法是依據(jù)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，測(cè)定蛋白質(zhì)的方法，如染料結(jié)合法、雙縮脲法和螢光法等，*常用的方法是開(kāi)氏法，但開(kāi)氏法測(cè)定的氮中還包含有氨基酸、酰氨等非蛋白質(zhì)氮，故稱(chēng)由此而計(jì)算出的蛋白質(zhì)為“粗蛋白質(zhì)”。如果蛋白質(zhì)用重金屬鹽等沉淀分離以后，進(jìn)行全氮測(cè)定，由氮換算而成的蛋白質(zhì)的含量，則稱(chēng)為“純蛋白質(zhì)”。

 

開(kāi)氏法是測(cè)定全氮量的經(jīng)典方法，被用于測(cè)定各種形態(tài)的有機(jī)氮。由于設(shè)備簡(jiǎn)單易得，結(jié)果可靠，為一般實(shí)驗(yàn)室所采用。

 

開(kāi)氏法測(cè)定籽粒中粗蛋白質(zhì)的方法原理是，根據(jù)同類(lèi)植物籽粒中蛋白質(zhì)的含氮量基本上是固定不變的。氮是蛋白質(zhì)中的主要成分。因此，可用開(kāi)氏法消煮定氮（參見(jiàn)土壤全氮的測(cè)定），再將測(cè)得的含氮值乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，即得粗蛋白質(zhì)含量。氮含量換算成蛋白質(zhì)的系數(shù)，一般采用6.25，這是由蛋白質(zhì)平均含氮16％為根據(jù)導(dǎo)出的值，但不同植物籽粒中蛋白質(zhì)的含氮量有差異，故由氮換算為蛋白質(zhì)的因數(shù)也稍有不同，如大麥、黑麥、燕麥籽粒的系數(shù)為5.83、大豆5.71、其他豆類(lèi)6.25。

 

但開(kāi)氏法操作手續(xù)較繁，分析的速度較慢，試劑費(fèi)用較高。近年，已經(jīng)出現(xiàn)幾種以開(kāi)氏法原理為基礎(chǔ)的全自動(dòng)或半自動(dòng)的開(kāi)氏定氮儀、蛋白質(zhì)分析儀。、這些儀器雖然自動(dòng)化程度較高，但價(jià)錢(qián)昂貴。

 

在生產(chǎn)和科研工作中，為了完成大批樣品的分析，需要采用快速、簡(jiǎn)易的分析方法，例如染料結(jié)合法、雙縮脲法、水合茚三酮法、亮磺化黃素螢光法、紅外光譜法、核磁共振法、以及測(cè)定開(kāi)氏消煮液中銨的靛酚藍(lán)比色法法和納氏比色法。

 

5.1.2同類(lèi)種子中蛋白質(zhì)的測(cè)定（染料結(jié)合法，DBC法）

 

方法原理蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（賴(lài)氨酸、精氨酸和組氨酸）的—NH₂、咪唑基和胍基，以及蛋白質(zhì)未端自由氨基在pH2～3的酸性緩沖液體系中呈陽(yáng)離子狀態(tài)存在，可以和偶氮磺酸染料類(lèi)物質(zhì)如桔黃G，酸性橙12等的陰離子結(jié)合，形成不溶于水的蛋白質(zhì)-染料絡(luò)合物而沉淀下來(lái)。通過(guò)測(cè)定一定量樣品與一定量體積的已知濃度染料溶液反應(yīng)前后溶液中染料濃度的變化，可計(jì)算出樣品的染料結(jié)合量，即每克樣品所結(jié)合的染料的毫克數(shù)。

 

染料結(jié)合量的大小反映出樣品中堿性氨基酸的多少。在小麥、大麥、水稻、大豆、花生等種子中，蛋白質(zhì)的含量與堿性氨基酸的含量之間有很好的相關(guān)性。因此，可以用染料結(jié)合量來(lái)評(píng)比同種作物種子大量原始材料之間蛋白質(zhì)含量的高低。

 

如果要從染料結(jié)合量來(lái)計(jì)算樣品的粗蛋白質(zhì)的含量，則需要用開(kāi)氏法測(cè)定同類(lèi)種子的一批樣品的粗蛋白質(zhì)，同時(shí)也用染料結(jié)合法測(cè)定其染料結(jié)合量，然后求出粗蛋白質(zhì)對(duì)染料結(jié)合量的回歸方程或繪出回歸曲線(xiàn)。這樣，測(cè)定未知樣品的染料結(jié)合量，就可以從回歸方程計(jì)算或查回歸曲線(xiàn)得到粗蛋白質(zhì)了。若只需比較蛋白質(zhì)含量的高低（如在篩選同種作物種子的大批樣品時(shí)），則不必知道蛋白質(zhì)的**含量，而只要測(cè)定樣品的染料結(jié)合量即可進(jìn)行比較。此法簡(jiǎn)單、快速，與開(kāi)氏法的相關(guān)性較好但準(zhǔn)確性較差，適用于大批樣品的篩選工作。

 

操作步驟

 

1. 樣品的測(cè)定稱(chēng)取0.25mm篩子的谷物樣品0.2～0.7g（x.xxx），放入30mL試管中，加入染料溶液20mL，蓋緊試管口，振蕩60min，使樣品和染料溶液充分反應(yīng)，取反應(yīng)后的渾濁液（8～10mL即可）注入離心管中以3000r min^-1的速度離心8～12min，至上部溶液澄清為止，以下操作步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

 

2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 與樣品測(cè)定的同時(shí)，取1000mgL^-1的染料溶液10、30、50、60、70、80mL放入100mL容量瓶中，用水定容，即得濃度系列為100、300、500、600、700、800 mgL^-1的染料標(biāo)準(zhǔn)溶液，可用GXD-201型蛋白質(zhì)分析儀測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；也可以把染料溶液用水稀釋50倍后，用0.5cm比色槽和482 nm的波長(zhǎng)測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

3. 回歸方程選取粗蛋白質(zhì)含量從低到高（如小麥種子粗蛋白質(zhì)含量可從7～17％）的同一類(lèi)谷物樣品35個(gè)左右，用開(kāi)氏法測(cè)其粗蛋白質(zhì)，并用上述方法測(cè)定各樣品的染料結(jié)合量。根據(jù)所得的結(jié)果，計(jì)算出染料結(jié)合量與蛋白質(zhì)之間的回歸方程。

 

從測(cè)得的未知樣品的染料結(jié)合量，求出蛋白質(zhì)的含量。

 

結(jié)果計(jì)算

 

樣品的染料結(jié)合量B = V*10^-3*（C0-C）/m

 

式中：

B：每克樣品所結(jié)合的染料的毫克數(shù)mg g ^-1；V：加入染料溶液的總體積mL；10^-3：將mL換算成L的系數(shù)C0：染料溶液的初始濃度，mgL^-1；C：染料結(jié)合反應(yīng)后殘余溶液中的染料濃度，mgL^-1；m：樣品的質(zhì)量，g。

 

注意事項(xiàng)

 

1. 在偶氮磺酸染料中，除桔黃G外，也可以使用酸性12（Acid Orange l2，縮寫(xiě)AO₁₂，C₁₆H₁₁O₄N₂SNa，分子量305.37），它的分子結(jié)構(gòu)與桔黃G基本相同，也含有一個(gè)偶氮發(fā)色基團(tuán)，但只有一個(gè)磺酸基，即一個(gè)結(jié)合堿基的位置（桔黃G二個(gè)），后者每個(gè)堿基結(jié)合點(diǎn)引起的顏色變化約是桔黃G的兩倍。故其更適合于在染料結(jié)合法中應(yīng)用，它們?cè)?82nm左右有一個(gè)較寬的吸收峰，便于比色測(cè)定。

2.樣品稱(chēng)樣量按蛋白質(zhì)含量的高低而定，水稻、小麥、大麥等樣品可稱(chēng)取0.5g，玉米稱(chēng)取0.7g，大豆稱(chēng)取0.2g，花生及魚(yú)粉等可少一些。

3.染料結(jié)合反應(yīng)的條件，如染料的pH、樣品的粒度、振蕩反應(yīng)的時(shí)間和溫度等都會(huì)影響測(cè)定的結(jié)果，故每次測(cè)定應(yīng)力求反應(yīng)條件一致，特別是在測(cè)定樣品與測(cè)定回歸方程的樣品時(shí)，反應(yīng)條件尤需一致。

 

5.1.3氨基酸的測(cè)定

 

氨基酸分析包括測(cè)定氨基酸的總含量及氨基酸中每個(gè)氨基酸的含量?jī)蓚€(gè)方面。測(cè)定氨基酸總量的方法與蛋白質(zhì)分析有密切的關(guān)系，許多測(cè)定蛋白質(zhì)全氮含量的方法如開(kāi)氏定氮法及各種比色法均可用于測(cè)定氨基酸的總含量。此外，測(cè)定氨基酸總含量的方法還有氨基氮的甲醛滴定法，測(cè)定ａ-氨基氮的范司克萊法及茚三酮比色法等。近代發(fā)展起來(lái)的各種色譜法是分析全氨基酸的有力工具。薄層層析是60年代發(fā)展起來(lái)的分析方法，它操作簡(jiǎn)便、設(shè)備簡(jiǎn)單、層析速度快、靈敏度高，已廣泛應(yīng)用于分離和測(cè)定氨基酸。近二十年來(lái)，應(yīng)用氣相色譜法分析氨基酸已進(jìn)行了大量的工作。氣相色譜法具有分析速度快、靈敏度高的特點(diǎn)，儀器的成本也比氨基酸自動(dòng)分析儀低。尤其是在分析氨基酸的對(duì)映異構(gòu)物及超微量（ng）樣品時(shí)，氣相色譜有特殊的作用。氨基酸自動(dòng)分析儀是應(yīng)用*廣泛的分析氨基酸的專(zhuān)用儀器

 

5.1.3.1谷物和飼料中賴(lài)氨酸的測(cè)定[染料結(jié)合法（DBL法）]

 

賴(lài)氨酸是一種入與動(dòng)物必需氨基酸，缺乏賴(lài)氨酸不僅不能正常發(fā)育，還會(huì)引起某些**。在絕大多數(shù)谷物中，賴(lài)氨酸是*缺乏的氨基酸，被稱(chēng)為“**限制氨基酸”。它在谷物貯存、加工過(guò)程中，又很不穩(wěn)定，易于脫去氨基、被氧化或是發(fā)生變質(zhì)而損失破壞，或變成營(yíng)養(yǎng)上的“無(wú)效”。因此賴(lài)氨酸的實(shí)際含量已成為衡量谷物、飼料蛋質(zhì)白品質(zhì)的重要指標(biāo)。

 

測(cè)定賴(lài)氨酸的方法很多，屬于化學(xué)的方法有2，4，6，三硝基苯磺酸（TNBS法），1-氟2，4-二硝基苯法（FDNB法）和2-氯-3，5-二硝基吡啶法（CNPY法）等，這些方法的共同缺點(diǎn)是操作手續(xù)冗長(zhǎng)費(fèi)時(shí)，還需要某些特殊的試劑，不適用于成批樣品的分析。離子交換色譜法（氨基酸自動(dòng)分析儀法）仍被認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)法，但儀器昂貴不能普及?，F(xiàn)在國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較廣泛的是簡(jiǎn)便易行的賴(lài)氨酸測(cè)定法。

 

方法原理染料結(jié)合法可用于測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的堿性氨基酸，包括賴(lài)氨酸、精氨酸和組氨酸。如果先將樣品用丙酸酐處理，丙酸酐便將賴(lài)氨酸的-NH₂?；诒?，使其失去了和染料結(jié)合的能力。然后，分別測(cè)定?；昂蟮腄BC值。?；暗臏y(cè)定值為賴(lài)氨酸、組氨酸、精氨酸的總和。而酰化后只是組氨酸和精氨酸，以上兩項(xiàng)測(cè)定結(jié)果的差值，就可計(jì)算出賴(lài)氨酸的含量。

 

操作步驟

 

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 配制濃度分別為1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9 mmolL^-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液（工作液）。吸取各工作液20.00 mL分別加入半飽和乙酸鈉溶液2.00mL及磷酸鹽緩沖液0.20mL，充分混勻，在GXD-201型蛋白質(zhì)分析儀上測(cè)定，繪制工作曲線(xiàn)。也可以用磷酸鹽溶液稀釋50倍后，用0.5cm比色槽和482nm波長(zhǎng)，以分光光度計(jì)測(cè)定，繪制工作曲線(xiàn)。

2. 樣品的測(cè)定稱(chēng)取0.1xx～0.8xxg（因樣品蛋白質(zhì)含量高低而定）已粉碎過(guò)60目篩四份，供制?；筒货；瘶悠犯鲀煞?。分別加入30～35mL具塞玻璃的或聚四氟乙烯的試管中，標(biāo)明為A、B管（?；瘶悠罚┖虲、D管（不酰化樣品）。同時(shí)應(yīng)另稱(chēng)樣品測(cè)定水分含量。

（1）丙?；磻?yīng) 各管分別加入160gL^-1乙酸鈉溶液2.00mL，然后加丙酸酐0.20mL于A(yíng)、B管中，加磷酸鹽緩沖溶液0.20mL于C、D管中。蓋緊塞子，放置在往復(fù)振蕩機(jī)上振蕩10 min。

（2）染料結(jié)合反應(yīng)向 A、B、C、D管中各加入染料溶液20.00mL，蓋緊塞子，置于振蕩機(jī)上振蕩1h，使染料結(jié)合反應(yīng)達(dá)到平

衡。

（3）離心 將以上反應(yīng)液在3000～4000 r min^-1下離心10min。

（4） 測(cè)定 在GXD-201型蛋白質(zhì)分析儀或分光光度計(jì)上測(cè)測(cè)。

 

結(jié)果計(jì)算

賴(lài)氨酸％（干基） =

{[3.89-（1.11*C_C.D）]/m_C.D-[3.89-（1.11*C_A.B）]/m_A.B} *20/1000*146.2/1000*100

 

式中：

C_A.B、C_C.D：各為?；c不?；瘶悠返氖Ｓ嗳玖先芤簼舛?，mmolL^-1；m_A.B、m_C.D：各為酰化與不?；瘶悠焚|(zhì)量，g；20：為加入染料溶液量，mL；1.11：為（20+2+0.2）與20之體積比；3.89：酸性橙紅染料溶液初始濃度，mmol L^-1；146.2：賴(lài)氨酸的摩爾質(zhì)量，gmol^-1。

 

5.2碳水化合物的分析

 

碳水化合物是綠色植物光合作用的主要產(chǎn)物，又是入類(lèi)和動(dòng)物體能量的主要來(lái)源，它在新陳代謝中起著重要的作用。在植物整個(gè)生命活動(dòng)中碳水化合物是僅次于蛋白質(zhì)、氨基酸的另一類(lèi)重要物質(zhì)，在農(nóng)產(chǎn)品評(píng)價(jià)利用中，很多都與碳水化合物密切相關(guān)。

 

碳水化合物主要包括水溶性糖、淀粉、纖維索等。農(nóng)產(chǎn)品中的水溶性糖主要有單糖（葡萄糖和果糖）及雙糖（蔗糖），由于它們都溶于水也溶于酒精，統(tǒng)稱(chēng)水溶性糖或可溶性糖。其分析意義，可分為三類(lèi)：①為研究植物不同生長(zhǎng)期體內(nèi)碳氮代謝；②分析水果、蔬菜中糖分，以評(píng)價(jià)其品質(zhì)及其在貯運(yùn)過(guò)程中含糖量的變化；③對(duì)甜菜、甘蔗等糖用作物以及動(dòng)物飼料中糖的分析等以鑒定其質(zhì)量。由于樣品中糖分的組成、含量不同和精度要求的不同，應(yīng)選擇不同方法進(jìn)行分析。

 

淀粉作為植物的貯藏物質(zhì)，大量地存在于禾谷類(lèi)作物種子和薯類(lèi)作物塊根、塊莖中，例如禾本科種子中淀粉含量可高達(dá)于重的50～80％，塊根、塊莖中可達(dá)鮮重的20～30％。淀粉是人們食品及家畜、禽飼料的主要成分，也是食品加工工業(yè)及輕工業(yè)的重要原料之一，對(duì)它們的分析，無(wú)疑是十分重要的。

 

纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，它常和半纖維索及木質(zhì)素在一起，是碳水化合物中較難分解的成分?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，纖維素有助于腸的蠕動(dòng)作用，因而對(duì)入類(lèi)健康大有裨益，主張多食用富含纖維索的果蔬類(lèi)；而飼料中纖維素含量又和粗、精飼料的配合有關(guān)，所以分析纖維素對(duì)食品及飼料皆有重要意義。

 

5.2.1水溶性糖的測(cè)定

 

農(nóng)產(chǎn)品中水溶性糖包括單糖（葡萄糖、果糖）、雙糖（蔗糖）。單糖是指用水解方法不能加以分解的碳水化合物，具有還原的特性，稱(chēng)為還原糖；蔗糖不具有還原性，稱(chēng)非還原糖。但蔗糖（雙糖）經(jīng)水解為單糖后，也具有還原性，糖的還原性質(zhì)與測(cè)定方法密切相關(guān)。

 

測(cè)定水溶性糖首先須用水（80oC）將其從試樣中浸提出來(lái)；也可以用乙醇浸提，后者是在樣品中含有大量淀粉和菊糖時(shí)采用。雙糖須經(jīng)水解轉(zhuǎn)化為還原糖后再測(cè)定。

 

測(cè)定還原糖的方法很多，有質(zhì)量法、容量法、比色法及旋光法等。重量法是以還原糖將費(fèi)林試劑還原產(chǎn)生Cu₂O稱(chēng)其質(zhì)量為基礎(chǔ)的經(jīng)典法。容量法按所用氧化劑不同可分為銅還原法和鐵還原法兩類(lèi)，前者常用費(fèi)林試劑為氧化劑；后者用鐵氰化鹽的堿性溶液為氧化劑。還原糖與氧化劑的反應(yīng)很復(fù)雜，常隨反應(yīng)條件（如加熱溫度和時(shí)間、試劑的濃度和堿度以及糖的濃度）而改變，不能按單一的反應(yīng)式來(lái)定量計(jì)算。因此所有的測(cè)定方法都是通過(guò)實(shí)驗(yàn)所得的經(jīng)驗(yàn)式或查經(jīng)驗(yàn)表來(lái)計(jì)算結(jié)果的。所以測(cè)定時(shí)必須極嚴(yán)格地遵照操作規(guī)程進(jìn)行，否則將產(chǎn)生相當(dāng)大的誤差。

銅還原-直接滴定法，操作簡(jiǎn)便，適用于含糖量較高瓜果、蔬菜等樣品；銅還原碘量法（半微量法），適用于含糖量低的牧草、蔬菜等樣品。另外，水溶性糖總量（包括還原糖和非還原糖），可以在浸提后經(jīng)稀HCl轉(zhuǎn)化測(cè)定水溶性糖總量。蔗糖含量可從水溶性糖總量減去水解前還原糖含量乘以0.95系數(shù)而求得。測(cè)定糖用作物（甘蔗、甜菜）中蔗糖的含量多用旋光法。

 

5.2.1.1單糖（還原糖）的測(cè)定

 

 

方法原理 用待測(cè)液滴定一定量的費(fèi)林試劑，根據(jù)一定量的費(fèi)林試劑所消耗的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖量，計(jì)算出待測(cè)液中的還原糖的含量。

 

還原糖與費(fèi)林試劑的作用如下：

①費(fèi)林試劑（A）與（B）等體積混合后，產(chǎn)生下列反應(yīng)，形成銅的酒石酸絡(luò)鹽：

Cu^2＋ ＋2OH^-十2C₄H₄O₆^2- →[Cu（C₄H₃O₆）₂]^4-+ 2H₂ O

 

②在煮沸的條件下，銅的酒石酸絡(luò)鹽與還原糖作用，將還原糖氧化和降解：

6[Cu（C₄H₃O₆）₂]^4-+ CH₂OH（CHOH）₄ CHO + 2OH^- +4H₂O →

 3CuO ↓+CH₂OH（CHOH）₃ COOH + CO^3- +12C₄H₄O₆^2-                                          

 

在用待測(cè)液滴定一定量的費(fèi)林試劑時(shí)，以亞甲基藍(lán)作為氧化還原指示劑。在滴定過(guò)程中，稍過(guò)量的還原糖可使氧化型亞甲基藍(lán)的藍(lán)色消失還原成無(wú)色的還原型亞甲基藍(lán)，即達(dá)滴定點(diǎn)。

 

還原糖與費(fèi)林試劑反應(yīng)的完全程度與滴定時(shí)的條件（如加熱強(qiáng)度、溫度、時(shí)間等）有關(guān)，必須嚴(yán)格按照規(guī)程操作。由于指示劑也能消耗一定量還原糖，所以每次滴定時(shí)須按規(guī)定加入相同數(shù)量的亞甲基藍(lán)。本法適宜于含糖量高的樣品（15～50mL待測(cè)液中含糖50 mg）。

 

操作步驟

 

1.待測(cè)液制備

（1）      水提取法：

**新鮮水果、蔬菜樣品外來(lái)污染的雜質(zhì)，盡可能快地磨細(xì)或切碎，混勻，稱(chēng)取樣品25.00～50.00g（含糖約2.5g），置高速組織搗碎機(jī)中，加適量水后搗碎（或置研缽中加少量純石英砂共同研磨），然后小心移入250mL容量瓶中，加水至約150 mL；或已風(fēng)干磨細(xì)的樣品則可稱(chēng)取0.500～5.00g，洗入250mL容量瓶中，亦加水至約150mL。然后加入粉狀CaCO₃ 0.5～1.5g中和樣品中的酸（防止浸提過(guò)程中蔗糖水解），搖動(dòng)1min，置于80℃水浴中保溫浸提30min，其間搖動(dòng)數(shù)次以利糖分浸提完全。冷卻，滴加中性乙酸鉛溶液至產(chǎn)生白色絮狀沉淀（約2～5mL），充分搖動(dòng)混合，靜置15min，再滴加幾滴中性乙酸鉛溶液于上部清液中檢查是否沉淀完全。如果還有沉淀形成，再搖動(dòng)，靜置，直至不產(chǎn)生白色絮狀沉淀為止，用水稀釋定容。用干濾紙過(guò)濾。加入足量固體草酸鈉到濾液中，使鉛沉淀完全，再用干濾紙過(guò)濾，再加少許固體草酸鈉到濾液中，檢查鉛是否沉淀完全，確認(rèn)無(wú)鉛后，濾液待用。

（2）乙醇提取法：稱(chēng)取剪碎、混勻的新鮮植株樣品（含大量淀粉或菊糖的樣品）25.00 g或干樣0.500～5.00g，放入400 mL燒杯中，加入85％乙醇150mL浸泡過(guò)夜（另測(cè)樣品水分），倒入高速組織搗碎機(jī)的杯中搗碎，再倒回原燒杯中，用80％乙醇將杯壁上的樣品洗凈，一同倒入燒杯中，過(guò)濾入250mL容量瓶中，再用80％乙醇少量多次洗滌殘?jiān)?，直至濾液無(wú)糖反應(yīng)為。*后以80％乙醇定容。吸取乙醇浸出液25.00～50.00mL（吸取量視含糖量與方法而定），放入瓷蒸發(fā)皿中，如溶液呈酸性，用固體CaCO₃中和，在60～80℃水浴上蒸干乙醇后，加入少量無(wú)CO₂水，用橡皮頭玻棒將干物質(zhì)洗下，邊攪邊加入Ba（OH）₂飽和溶液2～10mL，至溶液呈淡黃色（堿性），此時(shí)絮狀蛋白質(zhì)沉淀物浮在液面。加入酚酞指示劑1滴，在不斷攪動(dòng)下加入硫酸鋅溶液以沉淀過(guò)量的Ba²⁺，直到溶液呈微紅色時(shí)為止。過(guò)濾入50mL容量瓶中，用少量水洗滌沉淀后定容，待測(cè)。

2. 還原糖測(cè)定

（1）約測(cè)：準(zhǔn)確吸取費(fèi)林試劑（A）和B各5mL（或吸取混合費(fèi)林試劑10 mL），放入250mL角瓶中，由滴定管加入待測(cè)液約15mL，置于石棉網(wǎng)上用酒精燈加熱、煮沸，趁沸繼續(xù)滴加待測(cè)液，滴加速度約為10～15s之內(nèi)加入1mL直至溶液藍(lán)色即將消失，加入亞甲基藍(lán)指示劑3滴，繼續(xù)滴加待測(cè)液，直至藍(lán)色褪盡為止，記下待測(cè)液的用量（mL）。

（2）準(zhǔn)測(cè)：準(zhǔn)確吸取費(fèi)林試劑（A）和（B）各5mL（或吸取混合費(fèi)林試劑10mL），放入250mL角瓶中，加入待測(cè)液，其用量比約測(cè)時(shí)滴定量約少0.5～1.0mL，置于石棉網(wǎng)上用酒精燈加熱、煮沸，使之2min內(nèi)沸騰，維持沸騰2min后，加入亞甲基藍(lán)指示劑3滴，再逐滴地加入待測(cè)液，直至藍(lán)色褪盡。前后總沸時(shí)間為3min。準(zhǔn)確記下待測(cè)液的消耗量（V1），待測(cè)液的消耗量須在15～50mL范圍內(nèi)（含糖量近50mg），否則應(yīng)增加或減少稱(chēng)樣量，重新制備待測(cè)液。

3. 費(fèi)林試劑的標(biāo)定

同上操作條件，用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液也分“約測(cè)”及“準(zhǔn)確測(cè)定”兩步進(jìn)行。準(zhǔn)確記下消耗標(biāo)準(zhǔn)糖液用量（V0）（測(cè)定3次取平均值）。

 

結(jié)果計(jì)算

 

還原糖，% = C*V0*V*10^-3/（m*V1）*100

 

式中：

C：糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mg L^-1；V。：滴定10mL費(fèi)林試劑所消耗標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液的量，mL；V：滴定10mL費(fèi)林試劑所消耗待測(cè)液的量，mL；V1：待測(cè)液的總體積，mL；10^-3：將mL換算成L的系數(shù)；m：樣品質(zhì)量，g。

 

注意事項(xiàng)

 

無(wú)色的還原型亞甲基藍(lán)極易被大氣中的O₂所氧化，恢復(fù)原來(lái)的藍(lán)色，故整個(gè)滴定過(guò)程中三角瓶不能離開(kāi)燈火，使瓶中的溶液始終保持沸騰狀態(tài)，液面覆蓋水蒸汽，不與空氣接觸。

 

 

方法原理索姆吉試劑與還原糖作用生成Cu₂O沉淀，將沉淀用H₂SO₄酸化時(shí)，Cu₂O即溶解成Cu⁺，而索姆吉試劑中的KIO₃與KI在酸化時(shí)生成I₂：

 

KIO₃ + 5KI + 3H₂SO₄  → 3K₂ SO₄ +3H₂O + 3I₂

3CuO ↓

試劑中的KIO₃是定量加入的，所以生成的I₂也是一定量的。生成的I₂與Cu⁺發(fā)生氧化還原反應(yīng)，消耗一部分I₂：

 

2 Cu⁺ +I₂ →2Cu⁺ + 2I^-

 

溶液中與Cu⁺反應(yīng)后所剩余的I₂以淀粉為指示劑，用Na₂S₂O₃標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定：

 

I₂ +2S₂O₃^2- → S₄O₆^2- + 2I^-

在測(cè)定同時(shí)做空白標(biāo)定，以水代替糖試液。由空白標(biāo)定消耗的Na₂S₂O₃毫升數(shù)減去實(shí)測(cè)待測(cè)液消耗的Na₂S₂O₃毫升數(shù)，通過(guò)查表即得待測(cè)液中還原糖的毫克數(shù)。本方法適用于含糖少的蔬菜、牧草等樣品。

 

操作步驟

 

1. 糖溶液的提取 同銅還原-直接滴定法。

2. 還原糖的測(cè)定。吸取5mL（約0.5～2.5 mg還原糖）待測(cè)液放入25 x 200mm試管中，加索姆吉試劑5mL，搖動(dòng)混勻。試管口蓋以漏斗，在沸水浴中加熱15min，小心將試管平穩(wěn)地置于流動(dòng)冷水浴中4min；去蓋，沿管壁加入KI-K₂C₂O₄2Ml（溶液為堿性時(shí)不要搖動(dòng)）及硫酸溶液3mL，充分搖動(dòng)混勻，使CuO完全溶解；再于冷水浴中放5min，并搖動(dòng)2次，然后用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，至淺黃色時(shí)，加入淀粉5～10滴為指示劑，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失為終點(diǎn)。

按同樣的操作進(jìn)行空白標(biāo)定。由空白標(biāo)定與樣品測(cè)定所用毫升數(shù)之差，從表查得相當(dāng)?shù)倪€原糖毫克數(shù)，用已知量的標(biāo)準(zhǔn)糖溶液同樣進(jìn)行測(cè)定，可以校驗(yàn)表的數(shù)值。

 

結(jié)果計(jì)算

                 還原糖，％ = m ₁*10^-3/m*100

 

式中：

m ₁：查表所得還原糖質(zhì)量，mg；10^-3：將mg換算成g的系數(shù)；m：吸取的待測(cè)液中相當(dāng)?shù)臉悠焚|(zhì)量，g。

 

兩次平行測(cè)定結(jié)果允許相對(duì)偏差為5％。

 

5.2.1.2水溶性總量和蔗糖的測(cè)定

 

植物水溶性糖包括葡萄糖、果糖和蔗糖。其中，蔗糖須經(jīng)稀HCl水解生成轉(zhuǎn)化糖（生成等量的葡萄糖和果糖）后與其它的還原糖一起測(cè)定，即為水溶性總糖。

蔗糖的含量用差減法計(jì)算出。計(jì)算式如下：

蔗糖％ = （水溶性糖總量％ - 還原糖％）*0.95

式中：0.95為還原糖轉(zhuǎn)化為蔗糖的因數(shù)。

 

5.2.1.3糖料作物中蔗糖的測(cè)定（旋光法）

 

糖料作物主要指甘蔗和糖用甜蘋(píng)等，它們所含糖分幾乎全是蔗糖，前者可直接壓汁測(cè)定蔗糖含量，后者則須用水浸提后測(cè)定。測(cè)定蔗糖的的方法有旋光法、折光法和容量法等，其中廣泛采用的是旋光法，其特點(diǎn)是簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，但需用旋光計(jì)或檢糖計(jì)。比重法和折光法不夠準(zhǔn)確。沒(méi)有檢糖（旋光）計(jì)時(shí)，可以選用適于常量測(cè)定的化學(xué)方法，例如，蔗糖經(jīng)HCl水解轉(zhuǎn)化后，用銅還原-直接滴定法測(cè)定還原糖，再計(jì)算蔗糖的含量。

 

旋光法測(cè)糖的原理是基于糖類(lèi)分子具有不對(duì)稱(chēng)碳原子，可使通過(guò)的光的偏振面旋轉(zhuǎn)。當(dāng)光的波長(zhǎng)、溫度和液層厚度一定時(shí)，溶液中蔗糖的濃度與偏振光面旋轉(zhuǎn)角度成正比，因此，可用旋光計(jì)或檢糖計(jì)測(cè)定蔗糖的含量。各種糖類(lèi)都有其特定的比旋，例如蔗糖水溶液的比旋為+66.5，葡萄糖是+52.8，果糖是-92.8，麥芽糖是+118等。

 

5.2.3淀粉的測(cè)定

 

淀粉可直接被酸水解生成葡萄糖；或被酶水解生成麥芽糖和糊精，再經(jīng)酸水解生成葡萄   糖，可測(cè)定葡萄糖含量（還原糖）再計(jì)算出淀粉含量。酸水解法不僅使淀粉水解，而且也能分解半纖維素，結(jié)果產(chǎn)生了具有還原力的木糖、阿拉伯糖等單糖，使淀粉測(cè)定結(jié)果偏高。另外，淀粉經(jīng)分散和酸解后具有一定的旋光性，也可用旋光法測(cè)定淀粉含量。

 

淀粉是多糖聚合物，可用CaCl₂-HOAc（相對(duì)密度1.3，pH2.3）為分散和液化劑，在一定的酸度和加熱條件下，使淀粉溶解和部分酸解，生成具有一定旋光性的水解產(chǎn)物，可用旋光計(jì)測(cè)定。用此法時(shí)，各種淀粉的水解產(chǎn)物的比旋指定為203。國(guó)內(nèi)谷物淀粉分析方法標(biāo)準(zhǔn)化研究協(xié)作組認(rèn)為，本法結(jié)果的重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便、快速。

上帶有空氣冷凝管的塞子，使淀粉經(jīng)酶水解生成的糊精和麥芽糖再經(jīng)酸水解為葡萄糖。

 

5.2.4粗纖維的測(cè)定（酸性洗滌劑法，ADF）

 

長(zhǎng)期以來(lái)，測(cè)定粗纖維常用酸（H₂SO₄）堿（NaOH）交替浸煮法。該法操作手續(xù)冗長(zhǎng)，測(cè)定條件不易控制，而且試樣經(jīng)沸熱NaOH溶液處理時(shí)，木質(zhì)素有不等比例的溶解，使粗纖維的測(cè)得值偏低，從而使“無(wú)氮浸出物”含量偏高。酸性洗滌劑法（ADF）操作簡(jiǎn)便，是一個(gè)快速的方法。測(cè)得的“酸-洗滌劑纖維”較前法為高。酸-洗滌劑法對(duì)纖維素的回收率以及它的結(jié)果與樣品的消化率之間相關(guān)系數(shù)都高于前法。采用酸性洗滌劑法，必要時(shí)還可以接著分離測(cè)定酸不溶性木質(zhì)素。此法現(xiàn)已得到美、英等國(guó)的公認(rèn)。

 

方法原理 季按鹽（例如十六烷基**基溴化銨（CTAB），是一種表面活性劑，在硫酸溶液（0.5molL^-1）中能有效地使動(dòng)物飼料、植物樣品中蛋白質(zhì)、多糖、核酸等組分水解、濕潤(rùn)、乳化、分散，而纖維素及木質(zhì)素則很少變化。酸-洗滌劑法就是利用這個(gè)原理，將試樣用CTAB的H₂SO₄溶液（酸-洗滌劑）煮沸1h，過(guò)濾，洗凈酸液后烘干，根據(jù)殘?jiān)馁|(zhì)量計(jì)算酸性洗滌劑纖維（％）。本法適用于谷物及其加工品、飼料、牧草、果蔬等植物莖稈，葉、果實(shí)以及經(jīng)測(cè)定粗脂肪后的任何試樣中粗纖維的測(cè)定。

 

操作步驟

 

稱(chēng)取通過(guò)1mm篩的風(fēng)干試樣1.000 g或相當(dāng)量的鮮樣，放入250mL三角瓶中，在室溫    下加入酸性洗滌劑溶液100mL加熱，使之在5～10 min內(nèi)煮沸。剛開(kāi)始沸騰時(shí)計(jì)算時(shí)間，裝上冷凝管回流60min。注意調(diào)節(jié)加熱溫度，使整個(gè)回流過(guò)程始終維持微沸狀態(tài)。取下三角瓶，轉(zhuǎn)動(dòng)內(nèi)容物，用已知質(zhì)量（m1）的玻璃坩堝式濾器或古氏坩堝減壓抽濾。過(guò)濾時(shí)，先用傾瀉法過(guò)濾，將酸性洗滌劑溶液濾干后，用玻棒將殘?jiān)鼣嚿?，加?0～100oC的熱水傾洗3～4次，減壓抽濾，洗凈酸液后將殘?jiān)D(zhuǎn)移入濾器中，重復(fù)水洗，仔細(xì)沖洗濾器的內(nèi)壁，至酸-洗滌劑洗盡為止。用丙酮同樣洗滌濾器2、3次，直到濾出液無(wú)色為止。抽干濾渣中的丙酮，放入100oC鼓風(fēng)式干燥箱中干燥3h，冷卻后稱(chēng)其質(zhì)量（m2）。

 

結(jié)果計(jì)算

 

粗纖維（酸性洗滌纖維）％ = （m2-m1）/m*100

 

式中：m2：粗纖維和空坩堝質(zhì)量，g；m1：空坩堝質(zhì)量，g；m：烘干樣品質(zhì)量，g。

 

5.3 油料作物和谷類(lèi)作物籽粒中油脂的測(cè)定

 

脂類(lèi)在植物細(xì)胞和組織中存在形態(tài)可分為兩類(lèi)，一類(lèi)為游離態(tài)，另一類(lèi)為結(jié)合態(tài)。游離態(tài)油脂常常大量堆積于植物的貯藏器官中，以小滴形狀而存在。所以當(dāng)細(xì)胞被破壞并施以壓力，可以將個(gè)別小滴聯(lián)成大滴，而匯集到足夠的大滴時(shí)就得到了液體油。這就是榨油工業(yè)的基礎(chǔ)。另一種類(lèi)則是與其它成分相結(jié)合的脂類(lèi)。例如，存在于谷物等淀粉顆粒中以及植物營(yíng)養(yǎng)組織中結(jié)合態(tài)的脂類(lèi)。

 

種子的含油量因不同作物而不同，在同一作物的不同品種之間差異也很大，如大豆種子的含油量變動(dòng)在10～25％，一般約在15～18％。磷肥對(duì)提高植物含油量有良好的作用。

 

在農(nóng)業(yè)利用上為了評(píng)價(jià)谷類(lèi)和油料作物種子的品質(zhì)時(shí)，常常要測(cè)定游離態(tài)油脂含量；在評(píng)價(jià)動(dòng)、植物脂類(lèi)品質(zhì)時(shí)往往還需要鑒定其脂肪酸組成及其有關(guān)理化性質(zhì)。

 

測(cè)定作物種子中游離態(tài)袖脂的方法有油重法（直接法）和殘余法（間接法）。乙醚提取-直接測(cè)定油重法，結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定，廣為國(guó)內(nèi)外所采用，我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中將油重法作為仲裁法，但此法所用儀器每次只能測(cè)定一個(gè)樣品，不適宜于大批樣品的測(cè)定。間接測(cè)定殘余法適合于大批樣品的分析，分析效率較高，測(cè)定結(jié)果與油重法較為一致。在有精密折光儀的條件下，大批同種油料作物種子樣品含油量的測(cè)定，采用簡(jiǎn)單快速而準(zhǔn)確的折光法，*為方便。

 

 

方法原理油脂不溶于水，但能溶于乙醚（沸點(diǎn)35℃）、石油醚（30～60℃）、二硫化碳（46.3℃）、丙酮（56.5℃）、四氯化碳（70℃）、三氯甲烷（61℃）、苯（80℃）等有機(jī)溶劑中，因此可以用這些溶劑將植物樣品中油脂浸提出來(lái)，然后加熱趕去溶劑即可求得油脂含量。常用的溶劑為無(wú)水乙醚及石油醚，因其有低沸點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)，便于提??；但又有易著火爆炸等缺點(diǎn)，測(cè)定時(shí)務(wù)須嚴(yán)防著火爆炸。這些溶劑除提取出游離態(tài)脂肪外，也能提出“類(lèi)脂肪”，如磷脂、**醇、色索、蠟以及脂肪酸等脂溶性物質(zhì)，故稱(chēng)之為“粗脂肪”。

 

操作步驟

 

1.      試樣制備 選取代表性種子（小粒種子≥25g，大粒種子≥30g）。小粒種子，如油菜、芝麻，大粒種子如大豆、花生仁等。將樣品預(yù)先在80℃烘箱中干燥約2h。谷類(lèi)、大豆等經(jīng)粉碎后通過(guò)40目篩。帶殼油料種子如花生果、蓖麻籽、向日葵籽等，取樣量不得少于50g，通過(guò)剝殼，分別稱(chēng)重，計(jì)算出仁率。再用切片機(jī)或小刀片切成0.5mm以下薄片，籽仁粉碎至均勻粉狀。芝麻、油菜子用粉碎機(jī)或研缽細(xì)心研碎，注意不要留有整粒。樣品處理完畢，立即混勻，裝入磨口瓶中備用。

2. 測(cè)定 稱(chēng)取經(jīng)105℃烘干1h后粉碎試樣2～5g（**至0.001g）兩份，全部移入干燥濾紙筒內(nèi)（如無(wú)濾紙筒時(shí)也可使用濾紙包），試樣上面用脫脂棉塞住，以防試樣漂浮，然后移入浸提筒內(nèi)。事先將潔凈的接受器燒瓶100～105℃烘箱內(nèi)干燥0.5～1h，烘至恒重（m1），加入約占瓶體2／3體積的無(wú)水乙醚，把索氏提取器各部分連接起來(lái)，打開(kāi)冷凝水流，在水浴上進(jìn)行抽提。調(diào)節(jié)水浴溫度（夏天約65℃，冬天約80℃，切忌明火，注意室內(nèi)通風(fēng)），使冷凝下滴的乙醚速度為120～180滴／min，使乙醚不斷回流提取，一般浸提時(shí)間需8～10h。提取結(jié)束后，取下浸提筒，用鑷子取出圓筒濾紙，連接好浸提筒，在水浴中加熱蒸餾回收接受器燒瓶中的乙醚，用紗布擦凈燒瓶外部，取下燒瓶，在沸水浴上蒸去殘余的乙醚。將盛有脂肪的燒瓶放入105℃烘箱中，烘干1h，移入干燥器中冷卻至室溫后稱(chēng)重，**至0.001g。再烘30 min，冷卻，稱(chēng)重，直至恒重（m2）。

 

結(jié)果計(jì)算

 

粗脂肪，%（干基）（m2- m3）/ （m2- m1）*100

 

式中：

m1：接受燒瓶的質(zhì)量，g；m2：接受燒瓶和脂肪的質(zhì)量，g；m3：樣品的質(zhì)量，g。

帶殼油料種子粗脂肪％ = 籽仁粗脂肪％／出仁率％

 

平行測(cè)定的結(jié)果用算術(shù)平均值表示，保留小數(shù)后兩位。平行測(cè)定結(jié)果的相對(duì)相差，大豆不得大于2％，油料作物種子不得大于1％。

 

 

5.4有機(jī)酸和維生素分析

 

有機(jī)酸廣泛存在于植物體中，如在果蔬中主要含有蘋(píng)果酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸和草酸等。它們屬于弱酸類(lèi)，常以游離態(tài)及鉀、鈉、鈣鹽的形式存在于植物體內(nèi)，其成分及含量與植物品種、栽培條件及生長(zhǎng)狀況密切相關(guān)。有機(jī)酸作為酸味成分，其適宜的含量可增加果蔬的風(fēng)味，但過(guò)量時(shí)又顯示出**的品質(zhì)。因此，測(cè)定果蔬的酸度及其與糖含量的比值，能判斷果蔬的成熟度和品質(zhì)；而且有機(jī)酸在食品的加工、貯存、品質(zhì)管理、評(píng)價(jià)以及生物化學(xué)等領(lǐng)域，被認(rèn)為是重要的成分，常要對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中的總酸量、特定的有機(jī)酸進(jìn)行定量測(cè)定，乃至分析全部有機(jī)酸的組成。

 

有機(jī)酸量的多少、強(qiáng)弱常用酸度來(lái)表示。酸度的測(cè)定包括總酸度（可滴定酸度）、有效酸度（氫離子活度、pH值）和揮發(fā)性酸?？偹岫仁撬兴嵝猿煞值目偭?，通常用標(biāo)準(zhǔn)堿來(lái)測(cè)定并以樣品中所含主要酸的百分?jǐn)?shù)表示，但有的農(nóng)產(chǎn)品由于緩沖作用和色素的影響，往往難以判斷滴定終點(diǎn)，在這種情況下，可以使用電位滴定法。但是人們味覺(jué)中的酸度，主要不取決于酸的總量，而是取決于離子狀態(tài)的那一部分酸（游離酸），一般以氫離子活度（pH值）來(lái)表示，稱(chēng)為有效酸度。測(cè)定pH值的方法很多，其中以pH計(jì)較為準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便。至于各種有機(jī)酸的分離和定量，通常用柱層析法、紙層析法、氣相色譜法和羧酸分析儀法。

 

5.4.1總酸度的測(cè)定

 

 

方法原理樣品中的有機(jī)酸用堿滴定時(shí)，被中和生成鹽類(lèi)。用酚酞作指示劑，它在pH約8.2時(shí)達(dá)到終點(diǎn)。*后以NaOH的毫摩爾數(shù)來(lái)計(jì)算有機(jī)酸的含量。

 

操作步驟

 

在小燒杯中稱(chēng)取搗碎均勻試樣10～20 g，用約150mL水將其移入250mL容量瓶中，充分搖勻后稀釋定容。用干濾紙過(guò)濾，取濾液50mL，加入酚酞指示劑3～4滴，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色1min內(nèi)不褪色為終點(diǎn)。

 

結(jié)果計(jì)算

 

酸度％ = C*V*10^-3*K*k/m*100

式中：

C：標(biāo)準(zhǔn)溶液NaOH的濃度，molL^-1；V：NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量，mL；K：換算為適當(dāng)酸的系數(shù)，gmol^-1：蘋(píng)果酸67，檸檬酸64，含1分子水的檸檬酸70，乙酸60，酒石酸75，乳酸90；10^-3：將mL換算成L的系數(shù)；k：分取倍數(shù)；m：樣品的質(zhì)量，g。

 

注意事項(xiàng)

 

1. 本試驗(yàn)所用的蒸餾水應(yīng)經(jīng)煮沸除去二氧化碳。

2. 若顏色過(guò)深，可先加入等量蒸餾水稀釋后再滴定，或改用電位或電導(dǎo)滴定法。

 

5.4.2 有效酸度（pH值）的測(cè)定（電位法）

 

果蔬食品pH值的變動(dòng)不僅取決于原料品種和成熟度，而且取決于加工方法。其pH值與總酸度之間沒(méi)有嚴(yán)格的比例關(guān)系，pH值的大小不僅僅取決于酸的數(shù)量和性質(zhì)（種類(lèi)），而且受其中的酸、果膠、某些鹽類(lèi)和蛋白質(zhì)緩沖能力的影響。測(cè)定pH值的方法有pH試紙法、標(biāo)準(zhǔn)色管比色法和pH計(jì)測(cè)定法。其中以pH計(jì)法*準(zhǔn)確，操作也簡(jiǎn)便。

 

5.4.3 水果、蔬菜中有機(jī)酸組分的測(cè)定

 

 

有機(jī)酸是果、蔬的主要組成分之一。果、蔬中有機(jī)酸的種類(lèi)和含量變化很大。這些變化決定于品種、成熟度、氣候條件及其它因素，常用氣相色譜法、薄層色譜法、高效液相色譜法來(lái)測(cè)定有機(jī)酸。

 

方法原理 試樣經(jīng)處理后，直接將試樣液注入反相化學(xué)鍵合相色譜體系，用磷酸氫二銨溶液（5gL^-1）為流動(dòng)相，有機(jī)酸在兩相中分配分離，按照其碳原子數(shù)由少到多的順序從色譜柱中洗脫下來(lái)。用紫外檢測(cè)器（214nm）或示差折光檢測(cè)器檢測(cè)并與標(biāo)準(zhǔn)樣品比較定量。

 

操作步驟

 

1. 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 分別取適量有機(jī)酸單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣，如酒石酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸等于25mL容量瓶中，用氫氧化鈉溶液溶解后定容，配制標(biāo)準(zhǔn)濃度系列。

2. 樣品溶液的制備對(duì)于液體試樣需經(jīng)合適倍數(shù)稀釋?zhuān)肧ep-PAKC₁₈凈化柱處理，收集餾出液，經(jīng)0.45mm微孔濾膜過(guò)濾后備用；對(duì)于固體或半固體試樣，要將其搗碎，均質(zhì)后，加入一定量的氫氧化鈉溶液提取。經(jīng)離心分離或過(guò)濾后收集提取液，用Sep-PAKC₁₈凈化柱處理，收集餾出液，經(jīng)0.45 mm微孔濾膜過(guò)濾后備用。

3. 色譜條件：

       固定相：C₁₈鍵合相；

       流動(dòng)相：磷酸氫二銨溶液pH2.5；

        流速：2ml min^-1；

       進(jìn)樣量：10mL；

       檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器，214 nm，0.1 AUFS。

 

測(cè)定和計(jì)算

 

1. 將待測(cè)樣10mL注入色譜儀，根據(jù)其峰高或峰面積設(shè)定有關(guān)*佳參數(shù)如*小峰面積；

2. 注入有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液10mL，進(jìn)行色譜分析；

3. 以各標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間定性；

4. 根據(jù)有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各響應(yīng)值（峰高或峰面積）作一響應(yīng)值與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；

5. 分別注入待測(cè)樣10mL，進(jìn)行色譜分析；

6. 根據(jù)各待測(cè)樣的響應(yīng)值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出其相應(yīng)的含量。

 

若高效液相色譜儀配有微處理機(jī)，則不必配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，只要選擇與待測(cè)分析樣品濃度相近的（±10％以?xún)?nèi)）標(biāo)準(zhǔn)溶液注入色譜儀，仍以保留時(shí)間定性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的響應(yīng)值由計(jì)算機(jī)計(jì)算出校正因子，再由計(jì)算機(jī)用比例計(jì)算法作定量計(jì)算。

 

5.4.4 維生素的測(cè)定

 

維生素廣泛存在于各種生物體中，其種類(lèi)繁多，化學(xué)結(jié)構(gòu)與生理功能各異。因此無(wú)法按照結(jié)構(gòu)或功能分類(lèi)，按其溶解性可分為脂溶性（VA、VD、VE、VK）和水溶性（VB1、VB2、VB6、VB12、V_P、V_PP、VC）兩大類(lèi)。維生素是人體生命活動(dòng)不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，它們一般在動(dòng)物和人體內(nèi)不能合成或合成數(shù)量少，滿(mǎn)足不了動(dòng)物和人體的需要，必須依靠從食物中攝取。在食物中缺乏了任何一種維生素，人和動(dòng)物都會(huì)發(fā)生特有的缺乏癥狀，如缺乏維生素A、B和C時(shí)，可分別引起夜盲癥、**和壞血病等，嚴(yán)重時(shí)足以致命。某些維生素含量的高低，是評(píng)價(jià)農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。

 

測(cè)定維生素是一項(xiàng)比較復(fù)雜的工作。一般測(cè)定程序是：①用酸、堿或酶分解試樣，使其中的維生素游離出來(lái)；②用溶劑進(jìn)行提?。虎鄯蛛x子擾物質(zhì)，對(duì)樣液進(jìn)行分離提純；④用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行定量等。測(cè)定維生素的方法有微生物學(xué)測(cè)定法、生物學(xué)測(cè)定法等；儀器分析的方法有分光光度法、熒光分析法、薄層層析法、高效液相色譜法等。選用方法時(shí)應(yīng)根據(jù)試樣的品種、類(lèi)型、待測(cè)維生素的性質(zhì)、含量以及干擾物質(zhì)多少等因素來(lái)決定。

 

維生素C又稱(chēng)抗壞血酸，其純品為白色無(wú)臭結(jié)晶，熔點(diǎn)為190～192℃，溶于水或乙醇，不溶于油劑，在水溶液中易被氧化，在堿性條件下易分解，在弱酸條件下較穩(wěn)定。還原型（L-抗壞血酸）可被氧化為氧化型（L-脫氫抗壞血酸），但仍有一定的生理作用，如果進(jìn)一步水解則生成2，3-二酮古樂(lè)糖酸，便失去生理作用。通常所說(shuō)的總抗壞血酸包括還原型、氧化型抗壞血酸和2，3-二酮古樂(lè)糖酸。

 

測(cè)定維生素C含量的方法有2，6-二氯靛酚法、2，4-二硝基苯肼法、鉛-硫化氫法、碘量法、以及熒光分光光度法。2，6-二氯靛酚法用于測(cè)定還原型Vc，其它方法多用于測(cè)定總Vc的含量。

 

 

方法原理還原型抗壞血酸的分子中有烯二醇結(jié)構(gòu)存在，因此具有還原性，它能將藍(lán)色染料2，6-二氯靛酚還原為無(wú)色的化合物，而Vc則被氧化為脫氫Vc。

2，6．二氯靛酚具有酸堿指示及氧化還原指示的兩種特性，在堿性介質(zhì)中呈深藍(lán)色，而在酸性介質(zhì)中呈淺紅色（變色范圍pH4～5），其于氧化態(tài)時(shí)呈深藍(lán)色（堿介質(zhì)中）或淺紅色（酸性介質(zhì)），還原態(tài)時(shí)為無(wú)色。根據(jù)這個(gè)特性，用堿性藍(lán)色染料的標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定植物樣品酸性浸出液目的是保持反應(yīng)時(shí)一定的酸度，避免Vc在高pH時(shí)被空氣氧化。由于此染料不能氧化待測(cè)液中非Vc的還原性物質(zhì)，所以，對(duì)Vc有一定的選擇性。本法適用于測(cè)定一般水果、蔬菜樣品的還原型Vc（不包括脫氫Vc）。如試樣中含有Fe²⁺、Sn²⁺、Cu²⁺、SO₃^2-、S₂O₃^2-、SO₂等還原性雜質(zhì)，則有干擾。

 

操作步驟

 

1. 試樣處理

（1）新鮮果蔬試樣稱(chēng)取鮮樣50～100g，放入組織搗碎機(jī)的杯中，加入等重量的草酸浸提劑，快速搗碎1min，將試樣打成漿狀。試樣處理的整個(gè)過(guò)程應(yīng)在10min中內(nèi)完成，以免Vc被空氣氧化。用小燒杯稱(chēng)取漿狀物10～30 g（含還原型Vc1～5mg），放入100 mL容量瓶中，用草酸溶液定容，若有泡沫可加2滴辛醇除去。過(guò)濾，若濾液色深，影響滴定終點(diǎn)的判定時(shí)，可加1～2勺白陶土脫色。若樣液不易過(guò)濾，可用離心法分離。

（2）多汁果蔬試樣 可用紗布?jí)褐笤儆妹撝藁焖龠^(guò)濾，量取10～20 mL汁液，立即用草酸溶液定容至100mL。

（3）干試樣 稱(chēng)取1～4g（準(zhǔn)確至0.001g，含還原型Vc l～5mg）放入研缽中，加入草酸溶液研磨成漿狀液，洗入100 mL容量瓶中，用草酸定容。

（4）含有還原性物質(zhì)的試樣含有較多Fe²⁺的樣品可用乙酸代替草酸作為浸提劑。亞硫化脫水樣品，可于稀釋至一定容量之前加入20mL丙酮，以除去SO₂的干擾。

 

2. 測(cè)定 吸取無(wú)色濾液5～10.00mL（使含Vc約0.2～1mg范圍）放入50mL三角瓶中，用棕色半微量滴定管中裝的2，6-二氯靛酚標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淺紅色，約在15s內(nèi)不褪色為終點(diǎn)。同時(shí)以浸提劑做空白試驗(yàn)（空白值約0.08～0.10mL）。

 

結(jié)果計(jì)算

 

Vc，mg kg^-1 = （V-V0）*1000*T/m

式中：

V：滴定樣品液所用染料溶液體積，mL；V0：滴定空白所用染料溶液體積，mL；T：染料溶液的滴定度，mgmL^-1；m：滴定時(shí)樣品溶液中樣品的質(zhì)量，g。

 

注意事項(xiàng)

 

1.偏磷酸是Vc的*佳穩(wěn)定劑，且具有沉淀蛋白質(zhì)的作用，但其價(jià)格較貴，在室溫下放置易轉(zhuǎn)化為正磷酸，降低對(duì)Vc的穩(wěn)定性，草酸價(jià)廉易得，有與偏磷酸相近的穩(wěn)定性。而乙酸適于浸提含有Fe²⁺的樣品。

2.      草酸不應(yīng)置于日光下，以免產(chǎn)生過(guò)氧化物。當(dāng)有催化劑（如Cu²⁺）存在時(shí)，過(guò)氧化物能破壞Vc。

2，6-二氯靛酚溶液貯存時(shí)間太長(zhǎng)后發(fā)生會(huì)分解，使滴定終點(diǎn)不靈敏，因此應(yīng)在使用前檢查。

4. 使用白陶土?xí)r，要對(duì)每批新的白陶上測(cè)定對(duì)Vc的回收率。

5. 試樣中可能有其它還原性物質(zhì)也可使染料還原。但其還原染料的速度較慢，故滴定終點(diǎn)以淺紅色在15 s不褪色為準(zhǔn)。

 

 

維生素C總量包括還原型Vc、脫氫型VC和二酮古樂(lè)糖酸。先將試樣中的還原型抗壞血酸氧化為脫氫抗壞血酸，進(jìn)一步水解為二酮古樂(lè)糖酸。二酮古樂(lè)糖酸與2，4-二硝基苯肼法偶聯(lián)生成紅色的脎。其呈色的強(qiáng)度與二酮古樂(lè)糖酸濃度成正比，可以比色定量。

 

操作步驟

 

1. 試樣處理 稱(chēng)取適量試樣加等量的草酸溶液，在組織搗碎機(jī)中打成漿狀，取漿狀物20g用草酸溶液移入100mL容量瓶中，定容過(guò)濾。

3.      試樣中總Vc的測(cè)定 取濾液10 mL，加入草酸溶液10 mL（總Vc約1～10 mgL^-1），加一勺活性炭。搖1min，靜置、過(guò)濾。

各取濾液2 mL于樣品管和樣品空白管中，各管加入1滴硫脲溶液。于樣品管中加入2，4-二硝基苯肼溶液0.5mL，兩管都加上蓋子，置于37℃保溫箱中保溫3h。然后取出樣品管放入冰水中（終止反應(yīng)）。樣品空白管取出后冷卻至室溫，然后加入2，4-二硝基苯肼溶液0.5mL。然后將樣品管和樣品空白管皆置于冰浴中，從滴定管中滴加硫酸2mL于各管中，邊滴邊搖試管（防止溶液溫度上升，溶液中糖炭化而轉(zhuǎn)黑色）。

將各管從冰浴中取出，在室溫下放置30 min后，立即在分光光度計(jì)540 nm波長(zhǎng)處比色，測(cè)定。

3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 配制Vc標(biāo)準(zhǔn)工作液：含有2、4、6、8、10 mgmL^-1Vc的標(biāo)準(zhǔn)溶液。各取2mL于各標(biāo)準(zhǔn)管中，然后按上述之步驟測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

 

結(jié)果計(jì)算

 

Vc總量，mg kg^-1 =C*10^-3/m*1000

式中：

C：從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查得的1mL稀釋液中所含總抗壞血酸的質(zhì)量mgmL^-1；m：每1mL樣品稀釋液所含樣品的質(zhì)量，g；10^-3：將mL換算成L的系數(shù)；1000：1000g樣品中Vc總量的含量。

 

注意事項(xiàng)

 

1. 硫脲可防止Vc被氧化，且可幫助脎的形成，*終溶液中硫脲的濃度應(yīng)一致，否則影響色度。

2. 加入硫酸溶液后，試管從冰水中取出，溶液顏色會(huì)繼續(xù)變深，所以必須準(zhǔn)確加入硫酸后于30 min內(nèi)比色。