有害物質(zhì)的毒理學(xué)研究方法

環(huán)境質(zhì)量的惡化，不管起因是由于物質(zhì)因素，還是由于能量因素，測(cè)定這些因素的量或其他理化數(shù)據(jù)是環(huán)境監(jiān)測(cè)的重要內(nèi)容。但是單憑理化數(shù)據(jù)，是難以對(duì)環(huán)境質(zhì)量作出準(zhǔn)確評(píng)價(jià)的。因?yàn)榄h(huán)境是一個(gè)復(fù)雜體系，污染物種類繁多又含量多變，各種污染因素之間存在拮抗和加成作用。環(huán)境綜合質(zhì)量很難以各污染物個(gè)別影響來評(píng)價(jià)。利用生物在該環(huán)境中的反應(yīng)，確定環(huán)境的綜合質(zhì)量，無疑是理想的和重要的手段。生物監(jiān)測(cè)包括對(duì)生物體內(nèi)污染物的測(cè)定、生態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)法、生理生化評(píng)價(jià)法和**學(xué)評(píng)價(jià)法等，其中環(huán)境毒理學(xué)研究方法是通過用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)，確定污染物的毒性和劑量的關(guān)系，找出毒性作用的閾劑量（或閾濃度），為制訂該物質(zhì)在環(huán)境中的*高允許濃度提供資料；為防治污染提供科學(xué)依據(jù)；也是判斷環(huán)境質(zhì)量的一種方法。例如，有些有機(jī)合成化工廠，其排放廢水成分復(fù)雜，有微量的原料、溶劑、中間體和產(chǎn)品等，它們性質(zhì)又不穩(wěn)定，因此要分別測(cè)定這些物質(zhì)和確定主要有害因素往往是很困難，甚至實(shí)際上難以做到。但如果用魚類做毒性實(shí)驗(yàn)，并指定一個(gè)反映這些污染物的綜合指標(biāo)（例化學(xué)需氧量），那么確定該廢水的毒性和劑量是比較容易實(shí)現(xiàn)的。

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇及毒性試驗(yàn)分類

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇應(yīng)根據(jù)不同要求來決定。同時(shí)還要考慮動(dòng)物的來源、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和飼養(yǎng)管理等方面的因素。國(guó)內(nèi)外常用的動(dòng)物有小鼠、大鼠、兔、豚鼠、貓、狗和猴等。魚類有鰱魚、草魚和金魚等。金魚對(duì)某些毒物較敏感，特別是室內(nèi)飼養(yǎng)方便，魚苗易得，為國(guó)內(nèi)外所普遍采用。

不同的動(dòng)物對(duì)毒物反應(yīng)并不一致。例如，苯在家兔身上所產(chǎn)生的血象變化和人很相似（白細(xì)胞減少及造血器官發(fā)育不全），而在狗身上卻出現(xiàn)完全不同的反應(yīng)（白細(xì)胞增多及脾臟**結(jié)節(jié)增殖）；又如，苯胺及其衍生物的毒性作用可導(dǎo)致變性血紅蛋白出現(xiàn)，它在豚鼠、貓和狗身上可引起與人相類似的變化，但在家兔身上卻不容易引起變性血紅蛋白的出現(xiàn)，而對(duì)小白鼠則完全不產(chǎn)生變性血紅蛋白。要判斷某物質(zhì)在環(huán)境中的*高允許濃度，除了根據(jù)它的毒性外，還要考慮感官性狀、穩(wěn)定性以及自凈過程（地面水）等因素。另外，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所得到的毒性大小、**濃度和半致死濃度等數(shù)據(jù)也不能直接推斷到人體，還要進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查研究才能反映人體受影響情況。當(dāng)然，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒性試驗(yàn)無疑是極為重要的。

（二）毒性試驗(yàn)分類

毒性試驗(yàn)可分為急性毒性試驗(yàn)、亞急性毒性試驗(yàn)、慢性毒性試驗(yàn)和終生試驗(yàn)等。

1.急性毒性試驗(yàn)

一次（或幾次）投給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物較大劑量的化合物，觀察在短期內(nèi)（一般24小時(shí)到二周以內(nèi)）中毒反應(yīng)。

急性毒性試驗(yàn)由于變化因子少，時(shí)間短、經(jīng)濟(jì)以及容易試驗(yàn)，所以被廣泛采用。

2.亞急性毒性試驗(yàn)

一般用半致死劑量的1/5—1/20，每天投毒，連續(xù)半個(gè)月到三個(gè)月左右，主要了解該毒性有否積蓄作用和耐受性。

3.慢性毒性試驗(yàn)

用較低劑量進(jìn)行三個(gè)月到一年的投毒，觀察病理、生理、生化反應(yīng)以及尋找中毒診斷指標(biāo)，并為制訂*大允許濃度提供科學(xué)依據(jù)。

（三）污染物的毒性作用劑量污染物的毒性作用劑量可用下列方式表示（見表4－9）。

表4-9  污染物的毒性和劑量關(guān)系

由表4-9可以看出，污染物的毒性和劑量關(guān)系可用下列指標(biāo)區(qū)分：半數(shù)致死量（濃度），簡(jiǎn)稱LD₅₀，如氣體用濃度簡(jiǎn)稱LC₅₀；*小致死量（濃度），簡(jiǎn)稱MLD（MLC）；**致死量（濃度），簡(jiǎn)稱LD₁₀₀（LC₁₀₀）；*大耐受量（濃度），簡(jiǎn)稱MTD（MTC）。

半數(shù)致死量（濃度）是評(píng)價(jià)毒物毒性的主要指標(biāo)之一。由于其他毒性指標(biāo)波動(dòng)較大，所以評(píng)價(jià)相對(duì)毒性常以半數(shù)致死量（濃度）為依據(jù)。在魚類、水生植物、植物毒性試驗(yàn)中采用半數(shù)存活濃度（或中間忍受限度，半數(shù)忍受限度等，簡(jiǎn)稱TL_m）。

半數(shù)致死量的計(jì)算方法很多，這里介紹一種簡(jiǎn)便方法——曲線法，這是根據(jù)一般毒物的死亡曲線多為“S”形而提出來的。取若干組（每組至少10只）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在試驗(yàn)條件下，有一組全部存活，一組全部死亡，其他各組有不同的死亡率，以橫坐標(biāo)表示投毒劑量，縱坐標(biāo)為死亡率。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果在圖上作點(diǎn)，連點(diǎn)成曲線，在縱座標(biāo)死亡率50％處引出一水平線交于曲線，于交點(diǎn)作一垂線交于橫座標(biāo)，其所指劑量（濃度）即為半數(shù)致死量（濃度）。舉例說明：將表4－7的死亡率與投毒劑量繪成曲線，得到半致死量為39mg/kg，根據(jù)表4－8急性毒性分級(jí)表可以判斷該物質(zhì)為高毒。

表4－7 某化合物小鼠一次灌胃死亡情況

表4-8  急性毒性分級(jí)表

按染毒方式不同，毒性試驗(yàn)可分為吸入染毒、皮膚染毒，經(jīng)口投毒及注入投毒等。

二、吸入毒性試驗(yàn)

對(duì)于氣體或揮發(fā)性液體，通常是經(jīng)呼吸道侵入機(jī)體而引起中毒。因此，在研究車間和環(huán)境空氣中有害物質(zhì)的毒性以及*高允許濃度需要用吸入毒性試驗(yàn)。

（一）吸入染毒法的種類

吸入染毒法主要有靜態(tài)染毒法和動(dòng)態(tài)染毒法兩種。此外，還有單個(gè)口罩吸入法、噴霧染毒法和現(xiàn)場(chǎng)模擬染毒法等。

1.動(dòng)態(tài)染毒法

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放在染毒柜內(nèi)，連續(xù)不斷地將由受檢毒物和新鮮空氣配制成一定濃度的混合氣體通入染毒柜，井排出等量的污染空氣，形成一個(gè)穩(wěn)定的、動(dòng)態(tài)平衡染毒環(huán)境。此法常用于慢性毒性試驗(yàn)。

2.靜態(tài)染毒法

在一個(gè)密閉容器（或稱染毒柜）內(nèi)，加入一定量受檢物（氣體或揮發(fā)性液體），使均勻分布在染毒柜，經(jīng)呼吸道侵入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，由于靜態(tài)染毒是在密閉容器內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物呼吸過程消耗氧，并排出二氧化碳，使染毒柜內(nèi)氧的含量隨染毒時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，故而只適宜做急性毒性試驗(yàn)。在吸入染毒期間，要求氧的含量不低于19％，二氧化碳含量不超過1.7％。所以，10只小鼠的染毒柜的容積需要60L。染毒柜一般分為柜體、發(fā)毒裝置和氣體混勻裝置等三部分。柜體要有出入口、毒物加入孔、氣體采樣孔和氣體混勻裝置的孔口。圖4－6（圖略）是有機(jī)玻璃制造的染毒柜，容積為60L，發(fā)毒裝置隨毒物的物理性質(zhì)而異，*常用的方法是將揮發(fā)性的受檢物滴在紗布條、濾紙上或放在表面皿內(nèi)，再用電吹風(fēng)吹，使其揮發(fā)并均勻分布。對(duì)于氣體毒物，可在染毒柜兩端接兩個(gè)橡皮囊，一個(gè)空的，一個(gè)加入毒氣，按計(jì)算實(shí)驗(yàn)濃度壓入染毒柜，為一個(gè)橡皮囊即鼓起，再壓回橡皮囊，如此反復(fù)多次，即可混勻。也可直接將毒氣按計(jì)算壓入，借電風(fēng)扇混勻。

（二）吸入染毒法的注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)挑選健康、成年并同齡的動(dòng)物，雌雄各半。以小白鼠為例，選用年齡為兩個(gè)月，體重為20g左右，太大、太小均不適宜。每組10只，取若干組用不同濃度進(jìn)行試驗(yàn)，要求一組在試驗(yàn)條件下全部存活，一組全部死亡，其他各組有不同的死亡率，然后求出半數(shù)致死濃度（LC₅₀），對(duì)未死動(dòng)物取出后繼續(xù)觀察7—14天。了解恢復(fù)或發(fā)展?fàn)顩r，對(duì)死亡動(dòng)物（必要時(shí)對(duì)未死動(dòng)物）做病理形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)。

三、口服毒性試驗(yàn)

對(duì)非氣態(tài)毒物，可用經(jīng)消化道染毒方法。

（一）口服染毒法的種類

口服染毒法可分為灌胃法和飼喂法兩種。

1.飼喂法

將毒物混入動(dòng)物飼料或飲用水中，為保證使動(dòng)物吃完，一般在早上將毒物混在少量動(dòng)物喜歡吃的飼料中，待吃完后再繼續(xù)喂飼料和水。飼喂法符合自然生理?xiàng)l件，但劑量較難控制得**。

2.灌胃法

此法是將毒物配制成一定濃度的液體或糊狀物。對(duì)于水溶性物質(zhì)可用水配制，粉狀物用淀粉糊調(diào)勻。所用注射器的針頭是用較粗的8號(hào)或9號(hào)針頭，將針頭磨成光滑的橢圓形，并使之微彎曲。灌胃時(shí)用左手捉住小白鼠，盡量使之成垂直體位。右手持已吸取毒物的注射器及針頭導(dǎo)管，使針頭導(dǎo)管彎曲面向腹側(cè)，從口腔正中沿咽后壁慢慢插入，切勿偏斜。如遇有阻力應(yīng)稍向后退再徐徐前進(jìn)。一般插入2.5—4.0cm即可達(dá)胃內(nèi)。

（二）注意事項(xiàng)

灌胃法中將注射器向外抽氣時(shí)，如無氣體抽出說明已在胃中，即可將試驗(yàn)液推入小白鼠胃內(nèi)，然后將針頭拔出。如注射器抽出大量氣泡說明已進(jìn)入肺臟或氣管，應(yīng)拔出重插。如果注入后迅速死亡，很可能是穿入胸腔或肺內(nèi)。小白鼠一次灌胃注入量為體重的2—3％，*好不超過0.5mL（以1g/mL計(jì)）。

四、魚類毒性實(shí)驗(yàn)

在自然水域中，魚類如能正常生活，說明水體比較清潔；當(dāng)有毒工業(yè)廢水排入水體，常常引起大批魚的死亡或消失（回避）。因此，魚類毒性實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)成分復(fù)雜的工業(yè)廢水和廢渣浸出液的綜合毒性的有效方法。

（一）實(shí)驗(yàn)魚的選擇和馴養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)用魚以金魚*適宜，實(shí)驗(yàn)用魚必須是無病、健康的，其外觀是行動(dòng)活潑、體色發(fā)亮、魚鰭完整舒展，逆水性強(qiáng)，食欲強(qiáng)，并無任何魚病，魚的大小和品種都可能對(duì)毒物敏感度不同，因此同一實(shí)驗(yàn)中要求選用同一批同屬、同種和同齡的金魚，體長(zhǎng)（不包括尾部）約3cm，*大魚的體長(zhǎng)不超過*小魚體長(zhǎng)的一倍半。新選來的魚必須經(jīng)過馴養(yǎng)，使它適應(yīng)新的環(huán)境才能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。一般是在與實(shí)驗(yàn)條件相似的生活條件下（水溫、水質(zhì)等）馴養(yǎng)一周或10天以上，實(shí)驗(yàn)前四天*好不發(fā)生死亡現(xiàn)象。正式實(shí)驗(yàn)的前**應(yīng)停止喂食。因?yàn)槲故硶?huì)增加魚的呼吸代謝和排泄物，影響實(shí)驗(yàn)液的毒性。

（二）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

每種實(shí)驗(yàn)濃度為一組，每組至少10尾魚。為便于觀察，容器用玻璃缸，容積10L（以10尾魚計(jì)）左右，以保證每升水中魚重不超過2g。

1.實(shí)驗(yàn)液中溶解氧

溫水魚不小于4mg/L，冷水魚不小于5mg/L。如試驗(yàn)液中含有大量耗氧物質(zhì)時(shí)，為防止因缺氧引起死亡，應(yīng)采取措施?？刹捎酶鼡Q實(shí)驗(yàn)液，采用恒流裝置等。*好不要采用人工曝氣法。

2.實(shí)驗(yàn)液中的溫度

一般溫度高毒性大。所以通常以對(duì)魚類生存適宜的溫度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。冷水魚的適宜溫度在12—18℃，溫水魚的適宜溫度在20—28℃，同一實(shí)驗(yàn)中溫度變化為±2℃。

3.實(shí)驗(yàn)液中的pH

pH值對(duì)魚類生存有影響，通常控制在6.7—8.5之間。

實(shí)驗(yàn)和馴養(yǎng)用水是未受污染的河水和湖水。如用自來水必須經(jīng)過人工曝氣或自然曝氣三天以上，以趕走余氯和增加溶解氧，蒸餾水與實(shí)際差距太大，不宜作實(shí)驗(yàn)用水。

（三）實(shí)驗(yàn)步驟

1.預(yù)試驗(yàn)（探索性試驗(yàn)）

為保證正式實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，必須先進(jìn)行探索性試驗(yàn)，以觀察現(xiàn)象，確定實(shí)驗(yàn)的濃度范圍。選用的濃度范圍可大一些，每組魚的尾數(shù)可少一些。觀察24小時(shí)（或48小時(shí)）魚類中毒的反應(yīng)和死亡情況，找出不發(fā)生死亡、全部死亡和部分死亡的濃度。

2.實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)計(jì)和毒性判定

合理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)濃度，對(duì)實(shí)驗(yàn)的成功和**有很大影響。通常選7個(gè)濃度（至少5個(gè)），濃度間取等對(duì)數(shù)間距，例如：100、5.6、3.2、1.8、1.0（對(duì)數(shù)間距0.25）或10.0、7.9、6.3、5.0、4.0、3.6、2.5、2.0、1.6、1.26、1.0（對(duì)數(shù)間距0.1）。上面數(shù)值可用百分體積或mg/L表示。需要時(shí)也可用10的指數(shù)來乘或除，這些數(shù)值在對(duì)數(shù)紙上是等距離的。另設(shè)一對(duì)照組，對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)期間魚死亡超過10％，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能采用。

實(shí)驗(yàn)開始的前8小時(shí)應(yīng)連續(xù)觀察，隨時(shí)記錄。如正常，開始實(shí)驗(yàn)，做第24小時(shí)，48小時(shí)和96小時(shí)的觀察記錄。實(shí)驗(yàn)過程發(fā)現(xiàn)特異變化應(yīng)隨時(shí)記錄，根據(jù)魚的死亡情況、中毒癥狀判斷毒物或工業(yè)廢水毒性大小。如毒物的飽和溶液或所試工業(yè)廢水在96小時(shí)內(nèi)不引起實(shí)驗(yàn)魚的死亡時(shí)，可以認(rèn)為毒性不顯著。

魚類毒性實(shí)驗(yàn)的TL_m，是反映毒物或工業(yè)廢水對(duì)魚類生存影響的重要排標(biāo)，TL_m值的計(jì)算要求必須有使實(shí)驗(yàn)魚存活半數(shù)以上和半數(shù)以下的各濃度。在半對(duì)數(shù)紙上用直線內(nèi)插法推導(dǎo)，方法是以對(duì)數(shù)坐標(biāo)（縱坐標(biāo)）表示試樣濃度，用算術(shù)坐標(biāo)（橫坐標(biāo)）表示實(shí)驗(yàn)魚的存活百分?jǐn)?shù)，然后將實(shí)驗(yàn)結(jié)果標(biāo)在圖上。并將50％存活率上下二點(diǎn)連成直線，直線與50％存活直線相交，再從交點(diǎn)引一垂線至濃度坐標(biāo)，即為TL_m值。根據(jù)24、48、96小時(shí)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可分別得到24TL_m、48TL_m和96TL_m。按表4－9實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖4－8（圖略）即得24TL_m為6.7mg/L，48TL_m為4.7mg/L，96TL_m為3.56mg/L。

表4-9  某毒物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.魚類毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的實(shí)際應(yīng)用

魚類毒性實(shí)驗(yàn)的重要目的是推導(dǎo)毒物的**濃度。用TL_m推導(dǎo)**濃度的公式有多種，下面介紹二種公式：

（2）**濃度=48TL_m×0.1

按公式推導(dǎo)得到魚類生存**濃度后，要進(jìn)一步做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，特別是具有揮發(fā)性和不穩(wěn)定性毒物或廢水，應(yīng)當(dāng)用恒流裝置進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，96小時(shí)內(nèi)不發(fā)生死亡或中毒的濃度往往不能代表魚類長(zhǎng)期生活在被污染水體的**或無毒濃度。

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)是以推導(dǎo)所得的**濃度水溶液飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)魚一個(gè)月或幾個(gè)月，并設(shè)對(duì)照組進(jìn)行比較，如發(fā)現(xiàn)有中毒癥狀，則應(yīng)降低濃度再實(shí)驗(yàn)。

魚類毒性實(shí)驗(yàn)所得**濃度可為制訂該物質(zhì)在水中*高允許濃度的依據(jù)之一，也可作為管理工業(yè)廢水（成分復(fù)雜）排放的一種檢定方法。在河流、湖泊或海岸受污染時(shí)，可以通過各工廠廢水的魚類毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果找出主要污染源。魚類毒性實(shí)驗(yàn)也可作為廢水處理效果的鑒定指標(biāo)，即根據(jù)廢水處理前后的毒性改變，確定處理效果。

生物毒性實(shí)驗(yàn)在環(huán)境監(jiān)測(cè)、環(huán)境管理和衛(wèi)生評(píng)價(jià)等許多方面所顯示的優(yōu)點(diǎn)將會(huì)得到廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。

五、固體廢物的滲漏模型試驗(yàn)

固體廢物長(zhǎng)期堆放可能通過滲漏污染地下水和周圍土地，應(yīng)進(jìn)行滲漏模型試驗(yàn)。按圖4－9（圖略）把通過0.5mm孔徑篩的固體廢物裝入玻璃柱內(nèi)，在上面玻璃瓶中加入雨水或蒸餾水以 12mL/min的速度通過管柱下端的玻璃棉流入錐形瓶?jī)?nèi)，每隔一定時(shí)間測(cè)定滲漏液中有害物質(zhì)的含量，然后畫出時(shí)間-滲漏水中有害物濃度曲線。這一試驗(yàn)對(duì)研究廢物堆場(chǎng)對(duì)周圍環(huán)境影響有一定作用。

復(fù)習(xí)題和習(xí)題

1.什么叫有害工業(yè)固體廢物？其主要判別依據(jù)有哪些？

2.如何采集固體廢物樣品？采集后應(yīng)作怎樣處理才能保存？為什么固體廢物采樣量與粒度有關(guān)？

3.固體廢物的pH值測(cè)定要注意哪些方面？

4.什么叫急性毒性試驗(yàn)？為什么這是測(cè)定化學(xué)物質(zhì)毒性的常用方法？

5.以急性毒性試驗(yàn)為例，簡(jiǎn)述化學(xué)毒物*高允許濃度的實(shí)驗(yàn)求證方法。

6.魚類毒性試驗(yàn)在判別水體污染情況有何優(yōu)點(diǎn)？

7.進(jìn)行工業(yè)廢渣滲漏試驗(yàn)，對(duì)工業(yè)廢渣的處置有何現(xiàn)實(shí)意義？

8.生活垃圾有何特性，其監(jiān)測(cè)指標(biāo)主要是哪一些？

9.試述生活垃圾的處置方式，及其監(jiān)測(cè)的重點(diǎn)。

10.試述高熱值、低熱值的定義和它們之間的關(guān)系。

第五章  土壤污染監(jiān)測(cè)

土壤是指陸地地表具有肥力并能生長(zhǎng)植物的疏松表層。它介于大氣圈、巖石圈、水圈和生物圈之間，是環(huán)境中特有的組成部分。

土壤是植物生長(zhǎng)的基地，是動(dòng)物、人類賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此，土壤質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響人類的生產(chǎn)、生活和發(fā)展。但由于近些年人們不合理地施用農(nóng)藥、進(jìn)行污水灌溉等致使各類污染物質(zhì)通過多種渠道進(jìn)入土壤。當(dāng)污染物進(jìn)入土壤的數(shù)量超過土壤自凈能力時(shí)，將導(dǎo)致土壤質(zhì)量下降，甚至惡化，影響土壤的生產(chǎn)能力。此外，通過地下滲漏、地表徑流還將污染地下水和地表水。