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水中總大腸桿菌的測定
日期：2025-02-05 23:19
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摘要：
1 原理
總大腸桿菌群可用多管發(fā)酵法或?yàn)V膜法檢測。多管發(fā)酵法的原理是根據(jù)大腸菌群**能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣以及具備革蘭氏染色陰性，無芽孢，呈桿狀等有關(guān)特性，通過三個(gè)步驟進(jìn)行檢驗(yàn)，求得水樣中的總大腸菌群數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以*可能數(shù)（most probable number），簡稱MPN表示。
2 儀器
2.1 高壓蒸汽**器。
2.2 恒溫培養(yǎng)箱，冰箱。
2.3 生物顯微鏡，載玻片。
2.4 酒精燈，鎳鉻絲接種棒。
2.5 培養(yǎng)皿(直徑100mm)，試管(5×150mm)，小倒管，吸管(1，5，10ml)，燒杯(200，500，2000ml)，錐形瓶(500，1000ml)，采樣瓶。
3 培養(yǎng)基及染色劑的制備
3.1 乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：
將10g蛋白胨、3g牛肉浸膏、3g乳糖和5g氯化鈉加熱溶于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH為7.2－7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混勻，分裝于試管（內(nèi)有倒管）中，于121℃高壓**器中**15min，貯存于冷暗處備用。
3.2 三倍濃縮蛋白胨溶液：
按上述乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的制備方法制備。除蒸餾水外，各組分用量增加至三倍。
3.3 品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基
3.3.1 貯備培養(yǎng)基的制備
于2000mL燒杯中，先將20-30g瓊脂加到900mL蒸餾水中，加熱溶解，然后加入3.5g磷酸氫二鉀及10g蛋白胨，混勻，使其溶解，再用蒸餾水補(bǔ)充到1000mL調(diào)節(jié)溶液pH至7.2-7.4。趁熱用脫脂棉或絨布過濾，再加10g乳糖，混勻，定量分裝于250或500mL錐形瓶內(nèi)，置于高壓**器中，在121℃**15min，貯存與冷暗處備用。
3.3.2 平皿培養(yǎng)基的制備
將上法制備的貯備培養(yǎng)基加熱融化。根據(jù)錐形瓶內(nèi)培養(yǎng)基的容量，用**吸管按1：50比例吸取5%堿性品紅乙醇溶液，置于**空試管中；再按1：200比例稱取無水亞硫酸鈉，置于另一**空試管內(nèi)，加**水少許使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min（**）。用**吸管吸取已**的亞硫酸鈉溶液，滴加于堿性品紅乙醇溶液內(nèi)至深紅色再褪至淡紅色為止（不宜加多）。將此混合液全部加入已融化的貯備培養(yǎng)基內(nèi)，并充分混勻（防止產(chǎn)生氣泡）。立即將此培養(yǎng)基適量（約15mL）傾入已**的平皿內(nèi)，再冷卻凝固后置于冰箱內(nèi)備用，但保存時(shí)間不宜超過2周。如培養(yǎng)基由淡紅色變成深紅色則不能再用。
3.4 伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基制備
于2000mL燒杯中，先將20g瓊脂加到900mL蒸餾水中，加熱溶解，再加入2g磷酸二氫鉀及10g蛋白胨，混合使之溶解，用蒸餾水補(bǔ)充至1000mL，調(diào)節(jié)溶液pH值至7.2-7.4，趁熱用脫脂棉或絨布過濾，加入2%伊紅水溶液（0.4g伊紅溶于20mL水中）20ml和0.5%美藍(lán)水溶液（0.065g美藍(lán)溶于13mL水中）13ml，再加入10g乳糖，混勻后定量分裝于250或500mL錐形瓶內(nèi)，于121℃高壓**15min，放冷至45℃左右，無菌操作下將此培養(yǎng)基適量傾入已**的空平皿內(nèi)，待冷卻凝固后，置于冰箱內(nèi)備用。
3.5 革蘭氏染色劑
3.5.1 結(jié)晶紫染色液：
將20mL結(jié)晶紫乙醇飽和溶液（稱取4-8g結(jié)晶紫溶于100mL95%乙醇中）和80mL1%草酸銨溶液混合并過濾。該溶液放置過久會(huì)產(chǎn)生沉淀，不能再用。
3.5.2 助染劑：
將1g碘與2g碘化鉀混合后，加入少許蒸餾水，充分振蕩，待完全溶解后，用蒸餾水補(bǔ)充至300mL。此溶液2周內(nèi)有效。當(dāng)溶液由棕黃色變?yōu)榈S色時(shí)應(yīng)棄去。為易于貯備，可將上述碘與碘化鉀溶于30mL蒸餾水中，臨用前再加水稀釋。
3.5.3 脫色劑：95%乙醇。
3.5.4 復(fù)染劑：將0.25g沙黃加到10mL95%乙醇中待完全溶解后，加90mL蒸餾水。
4 測定步驟
4.1 生活飲用水
4.1.1 初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：在兩個(gè)裝有已**的50mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的大試管或燒瓶中（內(nèi)有倒管），以無菌操作加入充分混勻的水樣10mL，混勻后置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。
4.1.2 平板分離：上述各發(fā)酵管經(jīng)培養(yǎng)24h后，將產(chǎn)酸，產(chǎn)氣及只產(chǎn)酸的發(fā)酵管分別接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基或品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，挑選符合下列特征的菌落。
a.伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上：深紫黑色，具有金屬光澤的菌落；紫黑色，不帶或略帶金屬光澤的菌落：淡紫紅色，中心色較深的菌落。
b.品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上：紫紅色，具有金屬光澤的菌落；深紅色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；淡紅色，中心顏色較深的菌落。
4.1.3 取有上述特特征的群落進(jìn)行革蘭氏染色
a、 用已培養(yǎng)18－24h的培養(yǎng)物涂片，涂層要薄。
b、 將涂片在火焰上加溫固定，待冷卻后滴加結(jié)晶紫溶液，1min后用水洗去。
c、 滴加助染劑，1min后用水洗去。
d、 滴加脫色劑，搖動(dòng)玻片，直至無紫色脫落為止（約20－30s），用水洗去。
e、 滴加復(fù)染劑，1min后用水洗去，晾干、鏡檢，呈紫色者為革蘭氏陽性菌，呈紅色者為陰性菌。
4、復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：上述涂片鏡檢的菌落如為革蘭氏陰性無芽孢的桿菌，則挑選該菌落的另一部分接種于裝有普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中（內(nèi)有倒管），每管可接種分離自同一初發(fā)酵管（瓶）的*典型菌落1－3個(gè)，然后置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，有產(chǎn)酸、產(chǎn)氣者（不論倒管內(nèi)氣體多少皆作為產(chǎn)氣論），即證實(shí)有大腸菌群存在。根據(jù)證實(shí)有大腸菌群存在的陽性管（瓶）數(shù)查表2-5“大腸菌群檢數(shù)表”，報(bào)告每升水樣中的大腸菌群數(shù)。
4.2 水源水
4.2.1于各裝有5ml三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5個(gè)試管中（內(nèi)有倒管），分別加入10ml水樣；于各裝有10ml乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5個(gè)試管中（內(nèi)有倒管），分別加入1ml水樣；再于各裝有10ml乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5個(gè)試管中（內(nèi)有倒管），分別加入1ml 1：10稀釋的水樣。共計(jì)15管，三個(gè)稀釋度。將各管充分混勻，置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。
4.2.2 平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)的檢驗(yàn)步驟同“生活飲用水檢驗(yàn)方法”。
4.2.3 根據(jù)證實(shí)總大腸菌群存在的陽性管數(shù)，查附表2-6“*可能數(shù)（MPN）表”，即求得每100ml水樣中存在的總大腸菌群數(shù)。我國目前系以1L為報(bào)告單位，故MPN值再乘以10，即為1L水樣中的總大腸菌群數(shù)。
對污染嚴(yán)重的地表水和廢水，初發(fā)酵試驗(yàn)的接種水樣應(yīng)作1：10、1：100、1：1000或更高倍數(shù)的稀釋，檢驗(yàn)步驟同“水源水”檢驗(yàn)方法。
如果接種水的水樣量不是10ml、1ml和0.1ml，而是較低或較高的三個(gè)濃度的水樣量，也可查表求得MPN指數(shù)，再經(jīng)下面公式換算成每100ml的MPN值。
MPN值＝MPN指數(shù)×10（ml）/接種量*大的一管（ml）
表2-5 大腸菌群檢數(shù)表
接種水樣總量300ml（100ml2份，10ml 2份）
10mL水量的陽性管數(shù) | 100mL水量的陽性瓶數(shù) | ||
0 | 1 | 2 | |
1L水樣中大腸菌群數(shù) | 1L水樣中大腸菌群數(shù) | 1L水樣中大腸菌群數(shù) | |
0 | 3 | 4 | 11 |
1 | 3 | 8 | 18 |
2 | 7 | 13 | 27 |
3 | 11 | 18 | 38 |
4 | 14 | 24 | 52 |
5 | 18 | 30 | 70 |
6 | 22 | 36 | 92 |
7 | 27 | 43 | 120 |
8 | 31 | 51 | 161 |
9 | 36 | 60 | 230 |
10 | 40 | 69 | 230 |
表2-6 *可能數(shù)（MPN）表
（接種5份10ml水樣、5份0.1ml水樣時(shí)，不同陽性及陰性情況下100ml水樣中**數(shù)的*可能數(shù)和95％可信限值）
出現(xiàn)陽性份數(shù) | 每100ml水樣中 | 95％可信 限值 | 出現(xiàn)陽性份數(shù) | 每100ml水樣中 | 95％可信限值 | ||||||
10ml | 1ml | 0.1ml | **數(shù)的 | 下限 | 上限 | 10ml | 1ml | 0.1ml | **數(shù)的 | 下限 | 上限 |
管 | 管 | 管 | *可能數(shù) | 管 | 管 | 管 | *可能數(shù) | ||||
0 | 0 | 0 | <2 | 4 | 2 | 1 | 26 | 9 | 78 | ||
0 | 0 | 1 | 2 | <0.5 | 7 | 4 | 3 | 0 | 27 | 9 | 80 |
0 | 1 | 0 | 2 | <0.5 | 7 | 4 | 3 | 1 | 33 | 11 | 93 |
0 | 2 | 0 | 4 | <0.5 | 11 | 4 | 4 | 0 | 34 | 12 | 93 |
1 | 0 | 0 | 2 | <0.5 | 7 | 5 | 0 | 0 | 23 | 7 | 70 |
1 | 0 | 1 | 4 | <0.5 | 11 | 5 | 0 | 1 | 34 | 11 | 89 |
1 | 1 | 0 | 4 | <0.5 | 11 | 5 | 0 | 2 | 43 | 15 | 110 |
1 | 1 | 1 | 6 | <0.5 | 15 | 5 | 1 | 0 | 33 | 11 | 93 |
1 | 2 | 0 | 6 | <0.5 | 15 | 5 | 1 | 1 | 46 | 16 | 120 |
2 | 0 | 0 | 5 | <0.5 | 13 | 5 | 1 | 2 | 63 | 21 | 150 |
2 | 0 | 1 | 7 | 1 | 17 | 5 | 2 | 0 | 49 | 17 | 130 |
2 | 1 | 0 | 7 | 1 | 17 | 5 | 2 | 1 | 70 | 23 | 170 |
2 | 1 | 1 | 9 | 2 | 21 | 5 | 2 | 2 | 94 | 28 | 220 |
2 | 2 | 0 | 9 | 2 | 21 | 5 | 3 | 0 | 79 | 25 | 190 |
2 | 3 | 0 | 12 | 3 | 28 | 5 | 3 | 1 | 110 | 31 | 250 |
3 | 0 | 0 | 8 | 1 | 19 | 5 | 3 | 2 | 140 | 37 | 310 |
3 | 0 | 1 | 11 | 2 | 25 | 5 | 3 | 3 | 180 | 44 | 500 |
3 | 1 | 0 | 11 | 2 | 25 | 5 | 4 | 0 | 130 | 35 | 300 |
3 | 1 | 1 | 14 | 4 | 34 | 5 | 4 | 1 | 170 | 43 | 190 |
3 | 2 | 0 | 14 | 4 | 34 | 5 | 4 | 2 | 220 | 57 | 700 |
3 | 2 | 1 | 17 | 5 | 46 | 5 | 4 | 3 | 280 | 90 | 850 |
3 | 3 | 0 | 17 | 5 | 46 | 5 | 4 | 4 | 350 | 120 | 1000 |
4 | 0 | 0 | 13 | 3 | 31 | 5 | 5 | 0 | 240 | 68 | 750 |
4 | 0 | 1 | 17 | 5 | 46 | 5 | 5 | 1 | 350 | 120 | 1000 |
4 | 1 | 0 | 17 | 5 | 46 | 5 | 5 | 2 | 540 | 180 | 1400 |
4 | 1 | 1 | 21 | 7 | 63 | 5 | 5 | 3 | 920 | 300 | 3200 |
4 | 1 | 2 | 26 | 9 | 78 | 5 | 5 | 4 | 1600 | 640 | 5800 |
4 | 2 | 0 | 22 | 7 | 67 | 5 | 5 | 5 | ≥2400 | ||
